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【求助】PBMC怎么都没东西 已有2人参与
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得先说说我的样品，比较特殊，人外周血，EDTA抗凝管收集后，将血浆和血细胞分离开，分装成500ul/冻存管，直接从室温或冰浴中冻存到-80度，最久的已经半年，最近的一个月。 PBMC分离方法： 1、2管血细胞，共1ml血细胞从-80度直接置于37度水浴； 2、1ml血细胞与2ml Hank's（无钙镁），轻轻混合均匀； 3、将上述稀释血溶液，缓慢延壁添加到1.5ml淋巴细胞分离液（购于北京索莱宝公司，200ml，115元）上，有清晰的分层界面； 4、1500rpm，20min（实验室没有水平离心机，只有普通离心机，加速度与减速度都是很低的）； 5、发现分层后的情况是这样的：第一层，大量的红色溶液，按理说应该是血浆，但是成红色，担心是红细胞破裂导致；第二层是分离液，量与第一层相当，甚至稍少于第一层；在第一层与第二层之间有一层浅浅的红色的溶液；第三层是红细胞，特别少，就只是盖住离心管底部，在红细胞上面有一层白色的东西，感觉棉棉的，像白细胞； 6、将第一层，第二层包括两层中间的那层均另外吸出来，再2500rpm，20min，发现底部有些絮状物； 7、吸弃6中的上清，加入5ml Hank's溶液，轻轻混合，1500rpm，10min； 8、重复7； 9、吸弃上清，加入500ul 细胞冻存液，用枪吹打几次； 10、20ul 0.2%台盼蓝+20ul 9中的细胞悬液，5min后，加到血球计数板上。 但是结果是完全没有，所以我想问题是否有可能是： 1、我的样品根本没有办法做PBMC，可能细胞全部破裂？ 2、红细胞上面那层白色的棉状物是否其实就是单核细胞，本应该在再上一层，所以我的离心机是不行的，或者是否可以离心速率再降低到1000rpm？ 3、其他可能性？ 实在很愁啊，都做了2次了，望各位实验大牛们，帮忙解答~ |
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yglbuct
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