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linnan5945

铜虫 (初入文坛)

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专业: 污染物行为过程及其环境效

[求助] 【求助】PBMC怎么都没东西已有2人参与

得先说说我的样品，比较特殊，人外周血，EDTA抗凝管收集后，将血浆和血细胞分离开，分装成500ul/冻存管，直接从室温或冰浴中冻存到-80度，最久的已经半年，最近的一个月。
PBMC分离方法：
1、2管血细胞，共1ml血细胞从-80度直接置于37度水浴；
2、1ml血细胞与2ml Hank's（无钙镁），轻轻混合均匀；
3、将上述稀释血溶液，缓慢延壁添加到1.5ml淋巴细胞分离液（购于北京索莱宝公司，200ml，115元）上，有清晰的分层界面；
4、1500rpm，20min（实验室没有水平离心机，只有普通离心机，加速度与减速度都是很低的）；
5、发现分层后的情况是这样的：第一层，大量的红色溶液，按理说应该是血浆，但是成红色，担心是红细胞破裂导致；第二层是分离液，量与第一层相当，甚至稍少于第一层；在第一层与第二层之间有一层浅浅的红色的溶液；第三层是红细胞，特别少，就只是盖住离心管底部，在红细胞上面有一层白色的东西，感觉棉棉的，像白细胞；
6、将第一层，第二层包括两层中间的那层均另外吸出来，再2500rpm，20min，发现底部有些絮状物；
7、吸弃6中的上清，加入5ml Hank's溶液，轻轻混合，1500rpm，10min；
8、重复7；
9、吸弃上清，加入500ul 细胞冻存液，用枪吹打几次；
10、20ul 0.2%台盼蓝+20ul 9中的细胞悬液，5min后，加到血球计数板上。

但是结果是完全没有，所以我想问题是否有可能是：
1、我的样品根本没有办法做PBMC，可能细胞全部破裂？
2、红细胞上面那层白色的棉状物是否其实就是单核细胞，本应该在再上一层，所以我的离心机是不行的，或者是否可以离心速率再降低到1000rpm？
3、其他可能性？

实在很愁啊，都做了2次了，望各位实验大牛们，帮忙解答~

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1楼 2015-08-26 18:03:27

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lllzm

金虫 (小有名气)

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我稍微跟你说一下吧，因为我记不清了
1. 首先第一次离心最上层的浅红色是血小板。单核细胞冻存应该不担心破裂。
2. 第一次离心分层说明离心效果非常好
3. 后面的操作就不对了，为什么不直接吸你想要的，而是吸了好几层再离心呢。你的问题可能有两个原因，一是稀释掉了，二是时间过长离心液给细胞裂掉了。稀释掉了可能性最大
3. 台盼蓝是个什么意图，怕细胞看不见么。