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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)

这个说不好,以前我们也遇到过,你可以重做一次,或者把模板稀释一下
11楼2008-08-22 10:52:16
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董文娟

金虫 (小有名气)

10楼  没有提取DNA  是菌液PCR
12楼2008-08-22 11:09:05
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lybio

金虫 (正式写手)

我在提基因组时也遇到这问题,个人觉得是蛋白没除尽,后用苯酚氯仿抽提两次后,就没出现这问题了
13楼2008-08-23 16:11:21
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lybio

金虫 (正式写手)

菌液PCR啊,除了PCR仪95℃,5min,之前有没有用沸水浴煮5min?如果没的话,多加这步试试
14楼2008-08-23 16:14:16
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xxwju

金虫 (小有名气)

菌液PCR不稳定,建议抽提基因组后再PCR。
对于多数原核生物,只要将新鲜菌体直接酚氯仿抽提,无水乙醇沉淀,双蒸水溶解即可。速度快的,24管可控制在30 min之内,比菌液PCR多用20 min。但PCR产物一般较多,杂质少,利于测序。
15楼2008-08-24 08:49:44
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董文娟

金虫 (小有名气)

谢谢各位的热心解答
14楼 似乎没有煮沸  是师姐做的  但她没提有这一步
我负责跑电泳
16楼2008-08-25 09:42:05
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ningluztt

铜虫 (小有名气)

个人认为出现这种情况可能原因:商业化的polymerase为保持酶的稳定性,会在酶中加入BSA,PCR的时候polymerase的量加的过多,也就意味着BSA的量会增加,BSA留在点样孔导致堵塞使得DNA跑不下来,我们在实验的时候出现此类情况就是这个原因。
建议:PCR时50ul体系里的酶量不要超过5U.
17楼2008-08-25 10:41:21
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kitty-II

铜虫 (小有名气)

点样空里面的会不会是菌液的DNA,因为太大,而没有跑出来.
而下面没看到目标带,可能是更本就没有扩出来呢?
扩大体系是一个方法,因为如果你加的菌液量比较多,而体系又太小,相对的杂质浓度就高,会影响DNA聚合酶的扩增环境,导致扩增失败.
其实菌液PCR不是菌液加的越多越好,如果肉眼可以看到,就已经算很多了,做分子试验有时候要靠感觉,而不是眼睛,感觉沾到了就行!
18楼2008-08-28 16:19:22
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mythqu

新虫 (初入文坛)

是没有扩增出来吧,菌液PCR不需要煮沸的,估计你的扩增体系有问题,退火温度?你可以试试从菌液提取质粒直接做酶切鉴定插入片段。
基因克隆
19楼2008-08-29 14:02:35
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董文娟

金虫 (小有名气)

回复 19楼
做过质粒PCR, 但大小总和目的基因不相符  或扩不出来
所以才想从菌液里扩一下   
谢谢大家
20楼2008-08-30 16:46:35
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