应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 24孔板细胞RNA抽提一直失败，请教大侠分析并指导，重金悬赏，急急急！！！
131/2返回列表12下一页
查看: 6326  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

AIKX

金虫 (正式写手)

[求助] 24孔板细胞RNA抽提一直失败，请教大侠分析并指导，重金悬赏，急急急！！！ 已有4人参与

本人之前一直有进行RNA提取方面的实验，但主要为组织或者六孔板细胞RNA提取（均使用TRIZOL Reagent），结果都还不错。不过最近由于开展的细胞水平实验处理组较多，老师提议用24板培养细胞, 接种密度在200,000左右，按理说这个密度用于提取RNA足够，自己也试过直接用分离后的卵巢颗粒细胞（1ml）提取RNA，尽管Nanodrop检测A260/A230和A260/A280都略微偏低 （浓度约100ng/ul，最后溶解于18ul DEPC water），但是1.5%琼脂糖凝胶电泳检测能看到完整且单一的28S和18St条带 （比值至少1.5:1），这应该能够说明这个细胞量提取RNA不存在问题。不过当用24孔板培养细胞72h后 （细胞密度同上, 72h后覆盖率能到达70%以上，肉眼估计），我尝试使用1ml或者200ul Trizol提取RNA，但均未成功，RNA含量很低，大概4-60 ng/ul (最终溶解于16ul DEPC water), 且A260/A280在1.6左右而A260/A230低于0.8，电泳检测到非常微弱甚至无条带 （上样量3.5ul)。 具体操作步骤如下：
收集培养液之后，用预冷的PBS冲洗细胞两次，之后加入200ulTRIzol/ 孔，冰上放置2-3 min后， 用枪头反复吹打数次，显微镜下观察无细胞残留为止，将TRIZOL裂解液转移至新的1.5mL离心管，涡旋3min以充分裂解细胞，之后室温放置5min后加入40ul氯仿，剧烈震荡30sec后静置3min，然后于12,000g离心15min，吸取上清液约70ul至新的离心管，加入等量的异丙醇轻微振荡混匀后室温静置10min后，于12,000g离心10min, 弃去上清液，加入即配即用的1 ml 75%（DEPC水配制）洗涤两次 （7,500g 5 min）后弃去液体，之后短暂离心30sec，用中号枪头吸取多余液体后，置于空气干燥5min后，加15ulDEPC water溶解，最好保存至-80°冰箱。

用同样的方法试提组织RNA （200ul TRIZOL）结果很好，也尝试用1ml、500ul 提取24孔板RNA但也失败了，请教各位大侠是怎么从24孔板收集细胞并提取高质量的RNA （是否是加入PBS后，用细胞刷刮下细胞，然后转移至EP管，接着TRIZOL提取呢），可以share你的提取步骤吗？另外，是否有必要使用核酸助沉剂比如糖原等，后面沉淀过程中有使用醋酸钠吗？请各位指点，请大家分享下自己的经验，不甚感激！！
回复此楼

» 猜你喜欢
Fearskeeponesmall!
1楼 2015-08-19 06:00:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

AIKX

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by seeker91 at 2015-08-19 14:08:34
方法没问题，可能是细胞72小时后开始衰退了？
祝福祝福

谢谢回答哈 之前用六孔板做同样的实验  没有出现类似问题 无血清处理后 细胞可能会受到一些影响 但是也不至于提不出来呢 后面镜检的时候 感觉细胞量还是挺多的 基本有70%铺板率
赞一下(1人) 回复此楼
Fearskeeponesmall!
7楼2015-08-20 10:17:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
AIKX: 金币+2, 感谢回复！ 2015-08-19 10:42:03
那你用6孔板培养试试。
赞一下 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2015-08-19 10:18:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

AIKX

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2015-08-18 14:18:33
那你用6孔板培养试试。

谢谢您的回复，不过由于处理组过多，所以还是想用24孔板试试，现在主要想解决24孔板RNA提取问题。
赞一下 回复此楼
Fearskeeponesmall!
3楼2015-08-19 10:41:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

AIKX

金虫 (正式写手)
不要沉啊  自己先顶一个
赞一下 回复此楼
Fearskeeponesmall!
4楼2015-08-20 09:34:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seeker91

木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
AIKX: 金币+5 2015-08-20 23:04:56
方法没问题，可能是细胞72小时后开始衰退了？
祝福祝福
赞一下 回复此楼
5楼2015-08-20 10:08:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小翠迪

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
AIKX: 金币+3 2015-08-20 23:05:02
曾经遇到跟你一样的问题，自从用了OMEGA 总RNA提取试剂盒虽然有点像，但是我真的不是托……真的，谁用谁知道，推荐你用。当然建立在细胞密度比较好的基础上。
赞一下 回复此楼
6楼2015-08-20 10:12:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

AIKX

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小翠迪 at 2015-08-19 14:12:24
曾经遇到跟你一样的问题，自从用了OMEGA 总RNA提取试剂盒虽然有点像，但是我真的不是托……真的，谁用谁知道，推荐你用。当然建立在细胞密度比较好的基础上。

谢谢回答， 你有用这个提取24孔板RNA吗？
赞一下 回复此楼
Fearskeeponesmall!
8楼2015-08-20 10:18:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

AIKX

金虫 (正式写手)
另外，A260/A280及A260/A230是否与RNA量有很大关系呢？之前提取RNA时 如果能看到沉淀 这两个比率都挺好 但现在提24孔板RNA 看不到沉淀 两个比值都偏低
赞一下 回复此楼
Fearskeeponesmall!
9楼2015-08-20 10:21:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

y_123h

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
AIKX: 金币+5, ★有帮助, 主要想针对24孔板找到合适的方法 磁珠法以前用过 不过不知道24孔板用它效果如何？ 2015-08-20 22:40:54
建议使用磁珠法提取RNA，我用过杭州一家公司的磁珠法试剂盒，提取效率很高，而且价格不高，我们这边实验室用的都是这种方法，我们学校代理人的号码是15757111779
赞一下 回复此楼
不断的超越自我
10楼2015-08-20 16:39:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 AIKX 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭