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AIKX

金虫 (正式写手)

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[求助] 24孔板细胞RNA抽提一直失败，请教大侠分析并指导，重金悬赏，急急急！！！已有4人参与

本人之前一直有进行RNA提取方面的实验，但主要为组织或者六孔板细胞RNA提取（均使用TRIZOL Reagent），结果都还不错。不过最近由于开展的细胞水平实验处理组较多，老师提议用24板培养细胞, 接种密度在200,000左右，按理说这个密度用于提取RNA足够，自己也试过直接用分离后的卵巢颗粒细胞（1ml）提取RNA，尽管Nanodrop检测A260/A230和A260/A280都略微偏低（浓度约100ng/ul，最后溶解于18ul DEPC water），但是1.5%琼脂糖凝胶电泳检测能看到完整且单一的28S和18St条带（比值至少1.5:1），这应该能够说明这个细胞量提取RNA不存在问题。不过当用24孔板培养细胞72h后（细胞密度同上, 72h后覆盖率能到达70%以上，肉眼估计），我尝试使用1ml或者200ul Trizol提取RNA，但均未成功，RNA含量很低，大概4-60 ng/ul (最终溶解于16ul DEPC water), 且A260/A280在1.6左右而A260/A230低于0.8，电泳检测到非常微弱甚至无条带（上样量3.5ul)。具体操作步骤如下：
收集培养液之后，用预冷的PBS冲洗细胞两次，之后加入200ulTRIzol/ 孔，冰上放置2-3 min后，用枪头反复吹打数次，显微镜下观察无细胞残留为止，将TRIZOL裂解液转移至新的1.5mL离心管，涡旋3min以充分裂解细胞，之后室温放置5min后加入40ul氯仿，剧烈震荡30sec后静置3min，然后于12,000g离心15min，吸取上清液约70ul至新的离心管，加入等量的异丙醇轻微振荡混匀后室温静置10min后，于12,000g离心10min, 弃去上清液，加入即配即用的1 ml 75%（DEPC水配制）洗涤两次（7,500g 5 min）后弃去液体，之后短暂离心30sec，用中号枪头吸取多余液体后，置于空气干燥5min后，加15ulDEPC water溶解，最好保存至-80°冰箱。

用同样的方法试提组织RNA （200ul TRIZOL）结果很好，也尝试用1ml、500ul 提取24孔板RNA但也失败了，请教各位大侠是怎么从24孔板收集细胞并提取高质量的RNA （是否是加入PBS后，用细胞刷刮下细胞，然后转移至EP管，接着TRIZOL提取呢），可以share你的提取步骤吗？另外，是否有必要使用核酸助沉剂比如糖原等，后面沉淀过程中有使用醋酸钠吗？请各位指点，请大家分享下自己的经验，不甚感激！！