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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 原核表达始终构建载体不成功！！！！
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院士陈

铁虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达始终构建载体不成功！！！！ 已有4人参与

本人近几个月一直在做原核表达可是怎么都构建不出重组质粒，我要表达的目的基因全序列1950bp，起初做TA克隆都是一次性完成，但是当做表达切除信号肽加酶切位点时，片段大小约1900bp怎么都连不上表达载体，当实验室的师兄说先把片段连入T载体，再连表达载体，可是这时怎么都连不少T载体了，按理来说，片段变小了应该更好连才是呀，可是怎么都没连上每次连接都有算载体与目的DNA的质量比，就是1:3～1:8。可是就算这样还是没有的心好累，看不到前方的曙光，跪求木虫吧大神指点迷津，愿天下好人一生平安！！！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2015-08-11 00:34:15
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院士陈

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by liu208xj at 2015-08-17 13:48:46
信息量少，不好分析，有几个方面可以注意下
1）酶的质量
2）酶切位点设计是否恰当，也就是选的两个酶有没有冲突？是否是同尾酶？有没有协同作用等等
3）连接酶有没有问题，失活没有？

我送到公司了他们用的他们公司就是当下吹的那种百分之百可以连上的载体，也做出来阳性了序列我也看了些，可是当我对质粒酶切检测时发现居然连上的我的目的片段变小了，也是奇怪。但是我送的以前测序的样扩增出来也是对的呀，为什么连T载体居然变小了。。。更可气的是公司的人完全不动脑子，MD 我都说了我的目的片段多大还有我要连pmd19-t，居然用他们公司的，我想的用就用吧，妈的他们公司载体1.8k.我的目的片段1.9k这让我真怀疑他们有用脑子在做实验没

[ 发自小木虫客户端 ]
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16楼2015-08-20 02:42:11
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按照你的说法，那就是连接体系、连接条件可能有问题。把你的具体体系和条件写一下
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2楼2015-08-11 08:19:47
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jinxuan0904

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-14 23:29:20
先连到T-vector，再做酶切和胶回收，再按比例连~
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3楼2015-08-11 09:45:10
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zergbloody

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加285772160谈吧 具体跟你说一下

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4楼2015-08-11 10:37:24
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