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deity214

铁虫 (小有名气)

[交流] 请教：RT-PCR的条带跑不开是什么原因？

RT-PCR的条带跑不开是什么原因？

1.2%的琼脂糖凝胶
目的条带514bp
[search]RT-PCR[/search]

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-12 at 09:13 ]
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1楼 2008-08-15 13:05:12
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deity214

铁虫 (小有名气)
请大家分析一下这张电泳图可能出问题的地方

目的条带是扩增出来了，可是图太难看了，怎样改善一下？

1、为何每个条带都是两边浓，中间淡？
2、marker量我是加了2ul，有点淡
3、目的条带514bp，用多少的marker合适?我左边的是100bp ladder，右边是50bp ladder

谢了先！
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2楼2008-08-15 13:15:30
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
这个条带的分离还可以啦~~你要想跑开一点就胶做浓一点
染料加得不够就条带很淡，或者是胶太烫就加了染料分解了，要不然就是暴光参数没设好
问题1、上样没上好，分布不均匀~~~梳子太宽了，建议用薄梳子。要不然，上样的时候就小心一点，均匀地往孔里头加。
2、一般我都用5ul
3、100bp可以了~~~反正又500和514在这么稀的胶其实是差不多的
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3楼2008-08-15 14:36:59
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deity214

铁虫 (小有名气)
多谢多谢，回去再跑跑试试
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4楼2008-08-15 16:18:35
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deity214

铁虫 (小有名气)
染料加得不够就条带很淡，或者是胶太烫就加了染料分解了，要不然就是暴光参数没设好

溴化乙靛是5%的，曝光参数怎么设？

我这里是300nm紫外线灯看
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5楼2008-08-15 16:20:44
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复，积极交流
5%？
预染的话，貌似是1：20000的体积加原液……貌似而已，具体忘记了
后染的话，我没有明确计算过，反正加到TBE或者TAE里头，看到溶液有点发红就可以了，然后染5min，漂洗5min

曝光参数其实我说的是对比度、曝光时间、增益等~~
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6楼2008-08-15 20:04:26
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figo.339

木虫 (著名写手)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复，积极交流
6ul mark
用1.2%的胶可以，但是要多跑一段时间，你换换梳子试试，用窄的梳子
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7楼2008-08-15 23:46:46
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xiexinyao

银虫 (小有名气)

呵呵

可以试着把电压调低些看看
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8楼2008-09-04 15:24:50
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longxiange520

金虫 (小有名气)
条代淡主要可能和染料有关的，有时要是感觉太淡了，可以直接再染色一下吧，我一般１００毫升的胶加１微升的ＥＢ好像就可以了．
样加的少的话最好用小孔大梳子．
ＭＡＲＫＥＲ我一般是加５微升，效果好像还不错
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9楼2008-09-04 16:12:52
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