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deity214

铁虫 (小有名气)

[交流] 请教:RT-PCR的条带跑不开是什么原因?

RT-PCR的条带跑不开是什么原因?

1.2%的琼脂糖凝胶
目的条带514bp
[search]RT-PCR[/search]

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-12 at 09:13 ]
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deity214

铁虫 (小有名气)

请大家分析一下这张电泳图可能出问题的地方

目的条带是扩增出来了,可是图太难看了,怎样改善一下?

1、为何每个条带都是两边浓,中间淡?
2、marker量我是加了2ul,有点淡
3、目的条带514bp,用多少的marker合适?我左边的是100bp ladder,右边是50bp ladder

谢了先!
2楼2008-08-15 13:15:30
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
这个条带的分离还可以啦~~你要想跑开一点就胶做浓一点
染料加得不够就条带很淡,或者是胶太烫就加了染料分解了,要不然就是暴光参数没设好
问题1、上样没上好,分布不均匀~~~梳子太宽了,建议用薄梳子。要不然,上样的时候就小心一点,均匀地往孔里头加。
2、一般我都用5ul
3、100bp可以了~~~反正又500和514在这么稀的胶其实是差不多的
3楼2008-08-15 14:36:59
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deity214

铁虫 (小有名气)

多谢多谢,回去再跑跑试试
4楼2008-08-15 16:18:35
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deity214

铁虫 (小有名气)

染料加得不够就条带很淡,或者是胶太烫就加了染料分解了,要不然就是暴光参数没设好

溴化乙靛是5%的,曝光参数怎么设?

我这里是300nm紫外线灯看
5楼2008-08-15 16:20:44
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复,积极交流
5%?
预染的话,貌似是1:20000的体积加原液……貌似而已,具体忘记了
后染的话,我没有明确计算过,反正加到TBE或者TAE里头,看到溶液有点发红就可以了,然后染5min,漂洗5min

曝光参数其实我说的是对比度、曝光时间、增益等~~
6楼2008-08-15 20:04:26
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figo.339

木虫 (著名写手)

★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复,积极交流
6ul mark
用1.2%的胶可以,但是要多跑一段时间,你换换梳子试试,用窄的梳子
7楼2008-08-15 23:46:46
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xiexinyao

银虫 (小有名气)

呵呵

可以试着把电压调低些看看
8楼2008-09-04 15:24:50
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longxiange520

金虫 (小有名气)

条代淡主要可能和染料有关的,有时要是感觉太淡了,可以直接再染色一下吧,我一般100毫升的胶加1微升的EB好像就可以了.
样加的少的话最好用小孔大梳子.
MARKER我一般是加5微升,效果好像还不错
9楼2008-09-04 16:12:52
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