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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 毕赤酵母在筛选板上长的很好，但是PCR鉴定不出来是怎么回事？
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 毕赤酵母在筛选板上长的很好，但是PCR鉴定不出来是怎么回事？ 已有3人参与

我做的GS115，pPIC9k载体还有X33，pPICZαA载体。一个用His缺陷筛选，一个用zeocin浓度筛选。
  电转之后两者都长的很好，甚至zeocin 100ug/ml的板子，之前做电转都没长几个，这几次也长的不错。G418浓度也筛到0.3mg/ml了。
  可是我怎么都鉴定不出来。要不就是好不容易P出来，条带大小又不是很符合。
  通用引物又只P出来了一条带，所以我完全没办法确定到底是怎么回事。
  说没转进去吧，它又长的很好。说转进去了吧，我又P不出来。
  
  我用别人鉴定过的样品试验了一下，一端通用一端特异能P出来，但是两端通用结果也不好，一条酵母自身，一条空载500bp。
  然后PCR了我做电转的线性化质粒，也能P出条带。说明我的质粒，酶，体系都没啥问题吧？
  
  唯一的解释就是没转进去和没转进去该转的。
  没转进去，那不会长，我做了对照。虽然位转的酵母能在筛选平板上生长，但绝对不会长的这么密，而且个大圆润饱满。
  没转进去该转的，我的线性化质粒是新鲜的，已测序，从提质粒到纯化完成会跑两次胶确定大小。电转期间有什么步骤会让质粒破碎吗？那我之前做也没问题呀。
  考虑过质粒残留污染，恰好我期间用了一次全新的电击杯，用这些新电击杯的样，同样存在这种问题。
  并且之前也已经做了将近10次了，电击杯也一直重复利用，没有这种情况出现。
  
  再做，也不知道该从哪找原因了。求高人救救我吧！！半个月来就死在这了，实在不能相信居然连转三次P不出来。
  和从前唯一的区别是这三次去做我-80冻存过感受态，最多就冻存了4个小时，因为借的仪器，得配合那边的时间。但是冻存应该只影响转化效率吧，我的板子长的真心是好啊。到底是什么原因导致它鉴定不出来呢！！
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1楼 2015-08-06 16:04:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

棘白菌素

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子实验，有时候就是步骤都对，结果却总是有些偏差，所以说分子实验有个好运气也是很重要的，
看你分析的这么细致，我就画蛇添足一下，1、会不会是引物的问题，重新设计下引物；2、提取转化后的质粒，酶切鉴定，可以用多次多个限制性内切酶验证，查看是不是你的完整质粒。
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ggyy0911
青春留不住，白发自然生！
3楼2015-08-07 13:47:20
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普通回帖

awaken2013

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是直接菌落PCR还是提取了基因组在PCR？
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2楼2015-08-07 12:24:27
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 棘白菌素 at 2015-08-07 13:47:20
分子实验，有时候就是步骤都对，结果却总是有些偏差，所以说分子实验有个好运气也是很重要的，
看你分析的这么细致，我就画蛇添足一下，1、会不会是引物的问题，重新设计下引物；2、提取转化后的质粒，酶切鉴定 ...

谢谢回复~~~
  提取质粒做酶切是个好办法，确实比PCR靠谱。我这两天就安排做上。
  引物重新设计好像也不能优化到哪去了，毕竟之前我一直用这个引物，都能P出来。我从没启用过的干粉引物重配可以吗？
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4楼2015-08-07 15:51:42
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by awaken2013 at 2015-08-07 12:24:27
你是直接菌落PCR还是提取了基因组在PCR？

谢谢回复~
  菌落PCR的，用了Takara的裂解液。我觉得这个应该只存在假阳性的问题吧。
  因为有前面很多次的鉴定做对照，还有我用了别人的菌做了对照。之前几次和别人的菌用同样的裂解液是可以P出来的。一直以来我都还觉得这个方法挺靠谱的。
  请问一下你们是提酵母基因组再PCR的吗？是用的试剂盒还是玻璃珠法？我们实验室都没有玻璃珠……
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5楼2015-08-07 15:55:11
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棘白菌素

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ggyy0911 at 2015-08-07 15:51:42
谢谢回复~~~
  提取质粒做酶切是个好办法，确实比PCR靠谱。我这两天就安排做上。
  引物重新设计好像也不能优化到哪去了，毕竟之前我一直用这个引物，都能P出来。我从没启用过的干粉引物重配可以吗？...

哦，引物一般正常低温保存问题应该不大，重配不是很需要，当时引物比较富裕的话也可以啦~~~
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青春留不住，白发自然生！
6楼2015-08-07 16:54:51
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ggyy0911 at 2015-08-07 15:55:11
谢谢回复~
  菌落PCR的，用了Takara的裂解液。我觉得这个应该只存在假阳性的问题吧。
  因为有前面很多次的鉴定做对照，还有我用了别人的菌做了对照。之前几次和别人的菌用同样的裂解液是可以P出来的。一直以来我 ...

玻璃珠买就是了...takara的那个，反正我一次都没P出来过，我们实验室的曾经试过P出来，但是太不稳定。我建议你还是提基因组。
不要懒，不然浪费的时间会更多。
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7楼2015-08-07 17:39:42
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ggyy0911 at 2015-08-07 15:55:11
谢谢回复~
  菌落PCR的，用了Takara的裂解液。我觉得这个应该只存在假阳性的问题吧。
  因为有前面很多次的鉴定做对照，还有我用了别人的菌做了对照。之前几次和别人的菌用同样的裂解液是可以P出来的。一直以来我 ...

补充：我用玻璃珠提取后基因组后（同一株单菌落）PCR后是阳性。而酵母直接PCR 毛都没有。 就是那么的扯。
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8楼2015-08-07 17:42:01
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人车

木虫 (正式写手)
楼主 你好 我想问一下 我也是做毕赤酵母转化 想问一下 电击转化时 质粒量大约需要多少呢？ 我做了几次 平板已知都是不长菌
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9楼2015-08-24 10:46:48
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by awaken2013 at 2015-08-07 17:42:01
补充：我用玻璃珠提取后基因组后（同一株单菌落）PCR后是阳性。而酵母直接PCR 毛都没有。 就是那么的扯。...

我还做出了同一管菌液涂了两个板，一个板P出来，另一个板没P出来……然后隔天再做，能P出来的那个板也P不出来了……

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10楼2015-08-26 07:54:37
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