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ggyy0911铁虫 (正式写手)
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[求助]
毕赤酵母在筛选板上长的很好，但是PCR鉴定不出来是怎么回事？ 已有3人参与
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我做的GS115，pPIC9k载体还有X33，pPICZαA载体。一个用His缺陷筛选，一个用zeocin浓度筛选。 电转之后两者都长的很好，甚至zeocin 100ug/ml的板子，之前做电转都没长几个，这几次也长的不错。G418浓度也筛到0.3mg/ml了。 可是我怎么都鉴定不出来。要不就是好不容易P出来，条带大小又不是很符合。 通用引物又只P出来了一条带，所以我完全没办法确定到底是怎么回事。 说没转进去吧，它又长的很好。说转进去了吧，我又P不出来。 我用别人鉴定过的样品试验了一下，一端通用一端特异能P出来，但是两端通用结果也不好，一条酵母自身，一条空载500bp。 然后PCR了我做电转的线性化质粒，也能P出条带。说明我的质粒，酶，体系都没啥问题吧？ 唯一的解释就是没转进去和没转进去该转的。 没转进去，那不会长，我做了对照。虽然位转的酵母能在筛选平板上生长，但绝对不会长的这么密，而且个大圆润饱满。 没转进去该转的，我的线性化质粒是新鲜的，已测序，从提质粒到纯化完成会跑两次胶确定大小。电转期间有什么步骤会让质粒破碎吗？那我之前做也没问题呀。 考虑过质粒残留污染，恰好我期间用了一次全新的电击杯，用这些新电击杯的样，同样存在这种问题。 并且之前也已经做了将近10次了，电击杯也一直重复利用，没有这种情况出现。 再做，也不知道该从哪找原因了。求高人救救我吧！！半个月来就死在这了，实在不能相信居然连转三次P不出来。 和从前唯一的区别是这三次去做我-80冻存过感受态，最多就冻存了4个小时，因为借的仪器，得配合那边的时间。但是冻存应该只影响转化效率吧，我的板子长的真心是好啊。到底是什么原因导致它鉴定不出来呢！！ |
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4楼2015-08-07 15:51:42
ggyy0911
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5楼2015-08-07 15:55:11
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