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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 毕赤酵母在筛选板上长的很好，但是PCR鉴定不出来是怎么回事？
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 人车 at 2015-08-24 10:46:48
楼主 你好 我想问一下 我也是做毕赤酵母转化 想问一下 电击转化时 质粒量大约需要多少呢？ 我做了几次 平板已知都是不长菌

我没有精确的测过，不过每次线性化后纯化完，Marker和样都取5ul跑胶，和Marker里最亮的条带亮度差不多。每次10ul质粒混合80ul感受态。质粒浓度据说很重要，但我感觉应该和细菌转化一样，只影响转化子数量吧。

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11楼2015-08-26 07:58:25
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人车

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by ggyy0911 at 2015-08-26 07:58:25
我没有精确的测过，不过每次线性化后纯化完，Marker和样都取5ul跑胶，和Marker里最亮的条带亮度差不多。每次10ul质粒混合80ul感受态。质粒浓度据说很重要，但我感觉应该和细菌转化一样，只影响转化子数量吧。
...

我现在就是做电转一直长不出来 我是小提的质粒 之后进行酶切之后进行浓缩 也是10ul质粒混合80ul的感受态 之后电转 电转之后加入预冷的山梨醇 直接就涂RDB平板了 这是不是有问题呢 是不是需要复苏一下或者怎么样呢
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12楼2015-08-26 08:55:59
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 人车 at 2015-08-24 10:46:48
楼主 你好 我想问一下 我也是做毕赤酵母转化 想问一下 电击转化时 质粒量大约需要多少呢？ 我做了几次 平板已知都是不长菌

5-10ug
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13楼2015-08-26 22:09:47
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

不必纠结，我是直接做诱导实验。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
14楼2015-08-26 22:35:58
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 人车 at 2015-08-26 08:55:59
我现在就是做电转一直长不出来 我是小提的质粒 之后进行酶切之后进行浓缩 也是10ul质粒混合80ul的感受态 之后电转 电转之后加入预冷的山梨醇 直接就涂RDB平板了 这是不是有问题呢 是不是需要复苏一下或者怎么样呢...

应该不能直接涂吧……你电转完直接在电转杯里加1ml冰的山梨醇或者YPD和山梨醇各500ul混合，一定要冰的，一定要及时，因为刚电转完很热，冰的加进去效果最好。然后要孵育的，30度水浴静置或者低速30度摇床摇一会，时间你自己把握，会有浓度变化的，我的每次上摇床下来底下自己就沉积菌了，太浓了，也不好。

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15楼2015-08-27 10:34:03
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2015-08-26 22:35:58
不必纠结，我是直接做诱导实验。

诱导加上bmmy阶段一次就得7天呀……你的蛋白好诱导吗？我蛋白110kDa，我是担心诱导不出来，不能确定是到底是酵母里没质粒，还是没有诱导出来而已。这个能区分开吗？

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16楼2015-08-27 10:36:15
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yt19

金虫 (小有名气)
遇到同样的问题，也是p不出来，但是用质粒做阳性对照可以p出来，引物应该没问题，所以我就直接诱导表达了，看能否表达出来

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17楼2015-11-03 12:20:19
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田田den

新虫 (初入文坛)
楼主请问你最后这个问题解决了吗？我做的酿酒酵母醋酸锂转化，遇到了同样的问题，一直解决不了
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18楼2016-03-09 09:37:35
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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 棘白菌素 at 2015-08-07 13:47:20
分子实验，有时候就是步骤都对，结果却总是有些偏差，所以说分子实验有个好运气也是很重要的，
看你分析的这么细致，我就画蛇添足一下，1、会不会是引物的问题，重新设计下引物；2、提取转化后的质粒，酶切鉴定 ...

质粒是质粒片段整合进酵母基因组，又怎么会提出质粒来呢

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19楼2017-01-05 22:45:06
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kaoyanjiu

新虫 (小有名气)
楼主，我遇到的问题跟楼主有点类似。
1.有时候转化后，提基因组PCR验证，用通用引物能有两条带。
2.跟情况一转化条件一样，质粒线性化酶一样，PCR验证只有一条带，但诱导表达确实有我的目的蛋白。
综上，确定是否阳性转化子的PCRPCR结果到底怎么看，现在在寻求答案中，楼主解决了吗

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20楼2017-01-05 22:48:52
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