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BstX1酶切问题
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BstX1酶切问题 有用过BstX1的吗？ 我的质粒要BstX1和Hindlll双酶切，由于Hindlll Buffer M，37度，BstX1 Buffer H，45度。我先Hindlll 切，跑电泳看都切开了，其余的液体纯化回收，BstX1 切，结果切不动，过夜也不行。能给点建议吗？谢谢！ [ Last edited by 水草 on 2008-8-14 at 19:55 ] |
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2楼2008-08-14 19:38:49
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5楼2008-08-14 21:08:40
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reasonspare(金币+4,VIP+0):thx
水草(金币+5,VIP+0):感谢帮助！我的两个酶切位点较近，我再查查！十分感谢！
reasonspare(金币+4,VIP+0):thx
水草(金币+5,VIP+0):感谢帮助！我的两个酶切位点较近，我再查查！十分感谢！
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我的建议是先用难切开的酶单切，再用容易的酶单切。对于你的两个酶，明显BstX I 相对来说难切一些，所以建议先BstX I来切，在确保单切完全后回收，再用Hind III来酶切。 如果你的dna多的话，可以同时先分别用BstX I和Hind III单切，切开回收后在分别用Hind III和BstX I切，分别回收酶切产物。这样能节约时间。 另外，看你写的buffer，估计你用的takara的酶，我觉得他家常用酶还行，象BstX I这种，我还是信任NEB的，我看了看， NEB这个酶反应温度是55度呢。 还有一个问题，你这两个酶切位点间隔多少碱基？如果间隔少可能会影像你的酶切。 |
6楼2008-08-15 11:15:58
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xyklmu
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水草(金币+3,VIP+0):谢谢！我查查两个酶的距离，看图谱是很近。
水草(金币+3,VIP+0):谢谢！我查查两个酶的距离，看图谱是很近。
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楼主没有说清楚的是，你的两个酶切位点之间有多大的距离？？ 有时候距离太小的时候，第一个酶切过之后，影响了第二个酶切的位点识别。并不是说有酶切位点，这个酶就会结合上进行酶切的，有时候酶需要先结合在一些看似无关的DNA序列上，然后有一个识别的过程。所以我们有时在设计带酶切位点的引物进行pcr的时候，经常在酶切位点的5端额外设计几个无关的序列。 楼主可以把质粒的多克隆位点拷贝出来或者抓图，看看是否属于这个原因。还得详查这个酶的生产商的catolog，看有无这种情况。 另外，如果是空质粒的话，两个切点相距很近的时候，切开和没有切开你是如何判断的？有单酶切的对照吗？？ |
9楼2008-08-16 02:06:54
