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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » BstX1酶切问题
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水草

[交流] BstX1酶切问题

BstX1酶切问题

有用过BstX1的吗？

我的质粒要BstX1和Hindlll双酶切，由于Hindlll Buffer M，37度，BstX1 Buffer H，45度。我先Hindlll 切，跑电泳看都切开了，其余的液体纯化回收，BstX1 切，结果切不动，过夜也不行。能给点建议吗？谢谢！

[ Last edited by 水草 on 2008-8-14 at 19:55 ]
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1楼 2008-08-14 19:36:33
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jasco

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):thx
水草(金币+5,VIP+0):感谢帮助！我的两个酶切位点较近，我再查查！十分感谢！
我的建议是先用难切开的酶单切，再用容易的酶单切。对于你的两个酶，明显BstX I 相对来说难切一些，所以建议先BstX I来切，在确保单切完全后回收，再用Hind III来酶切。

如果你的dna多的话，可以同时先分别用BstX I和Hind III单切，切开回收后在分别用Hind III和BstX I切，分别回收酶切产物。这样能节约时间。

另外，看你写的buffer，估计你用的takara的酶，我觉得他家常用酶还行，象BstX I这种，我还是信任NEB的，我看了看， NEB这个酶反应温度是55度呢。

还有一个问题，你这两个酶切位点间隔多少碱基？如果间隔少可能会影像你的酶切。
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6楼2008-08-15 11:15:58
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
水草(金币+2,VIP+0):谢谢！
如果是先BstX1呢？有没有试过
如果这样还切不动那么怀疑是酶的问题
当然不排除DNA提得不干净（但也不至于完全切不动）
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2楼2008-08-14 19:38:49
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
水草(金币+4,VIP+0):谢谢！
用BstX1酶单切，
如果切不开，就考虑酶本身的问题，解决方法，再买一支酶
如果切开了，那就是楼主先用HindIII切完后对DNA造成的影响，解决方法，先用BstX1酶单切，回收后再用HindIII切
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3楼2008-08-14 20:26:14
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chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
水草(金币+10,VIP+0):谢谢！我去试试。
补充一点
从BstX1本身的识别序列分析，
5' ... C C A N N N N N^N T G G ... 3'
3' ... G G T N^N N N N N A C C ... 5'
可见其为大亚基的限切酶
这种酶从动力学过程上来说，对环型DNA的切割很容易比对线型DNA切割效果好，
分子过程是结合于DNA上某些序列，向下扫描至酶切位点
而本身的环型结构也利于酶的切割
所以在酶确定好使的情况下，强烈建议楼主先进行BstX1的酶切
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4楼2008-08-14 20:43:11
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