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三磷酸腺苷铁杆木虫 (职业作家)
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[交流]
基于慢病毒的microRNA表达系统-交流转帖
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未来一段时间可能想做一个miRNA的稳定转染 所以想找有没有现成的表达载体 自己包装的话挺麻烦的 搜了一下，国外的有Invitrogen、Thermo，国内的有康成（不过似乎也是跟外国公司挂钩的吧） 钱不是问题，要的是效果 不知道有没有人用过，觉得哪个公司好，交流一下～～～ ------------------------ 8.13 接到版主的奖励通知，呵呵，有点受宠若惊 在此把原来的帖子更名，作为交流专用帖 希望大家能够在这里多多发表，共同交流 比如，什么公司的产品可靠，包装时需要注意什么问题，会不会对哪些细胞产生明显的毒性等等 也不一定专限于miR，其他的基于慢病毒的siRNA表达系统问题也可以在此讨论 我跟Invitrogen要了一些资料，待会我整理完后再跟帖发上来 [ Last edited by 三磷酸腺苷 on 2008-8-13 at 09:28 ] |
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2楼2008-08-11 14:25:47
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7楼2008-08-13 09:28:58
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xyklmu(金币+5,VIP+0):谢谢，辛苦了，^_^
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稍微看了一下，Invitrogen的东西说得不是很清楚啦 质粒是pLenti6/V5-DEST，长度8688bp，能够为Pol II所启动表达 荧光基因是EmGFP，据产品介绍说和miR的表达是100%相关的（存在于miR基因的上游） miR的序列是上网自己设计的http://www.invitrogen.com/rnai 该载体的最大特色是可以同时插进两个miR基因，实现一个载体共表达两个miR的功能 大概就这么多~~不知道有没有什么牛的paper曾经用过这个产品 如果说有公司是把整个miR的慢病毒library做出来就爽了，省得自己设计和包装 |
8楼2008-08-13 09:59:22
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这个是国内康成生物的资料~~~
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使用慢病毒表达系统pre-microRNA载体构建技术服务 使用慢病毒系统构建pre-microRNA载体，保证pre-microRNA和内源性microRNA合成机的相关的调节因子相互作用，有利于pre-microRNA在运输蛋白作用下从细胞核进入细胞质，并在Dicer等相关蛋白作用下，剪切得到成熟microRNA从而发挥生物学作用。使用慢病毒表达系统还可将pre-microRNA表达载体转染到难转染的细胞中；并且促进pre-microRNA整合到宿主细胞基因组中，有利于筛选稳转细胞株，稳定地降低靶基因的表达。 pre-microRNA表达载体的特点 1、多顺反子模式的设计简化了对转染细胞的鉴定 pre-microRNA表达载体表达多顺反子转录本，包含copGFP荧光标志、Zeocin抗性基因和 pre-microRNA（Fig.1）。这种设计简化了对表达pre-microRNA的细胞的鉴定和富集。  Pre-microRNA expressing vector Fig1 pre-microRNA表达载体结构图 2、RNA聚合酶Ⅱ启动子保证了从单拷贝的整合子强烈表达pre-microRNA 表达非常短的siRNA和shRNA通常使用pol-Ⅲ启动子，而使用pol-Ⅱ启动子更能有效表达 microRNA初级转录本（Stegmeier,2005）。pre-microRNA表达载体使用CMV启动子启动 表达pre-microRNA（Fig.1）。CMV启动子具有强启动子活性保证了从单拷贝整合子高水平的 表达pre-microRNA。 3、慢病毒表达系统有利于载体转染及整合 将pre-microRNA分子克隆到基于慢病毒的载体上，和其他标准质粒载体一样， pre- microRNA表达载体通过传统的转染方法转染到细胞中能够瞬时表达pre-microRNA。更重要的 是，由于含有编码病毒核心蛋白的基因，该表达载体可以被包装到假病毒颗粒中，将载体转染到 难转染的细胞株中，如原代细胞、干细胞及不分化细胞等；而且插入片段（pre-microRNA）整 合到宿主细胞基因组中的几率大大增加，有利于筛选获得持续表达pre-microRNA的稳定细胞 株。microRNA被认为参与各种细胞信号途径，因此特异性表达microRNA的稳定细胞株便可作 为一种将microRNA和生物学功能联系到一起的独特的研究工具。 插入序列的特点：从天然的基因组序列中表达pre-microRNA转录本 构建pre-microRNA表达载体时的插入序列不仅包含Sanger’ miRBase数据库中列出的成熟体microRNA的序列，还包含茎环结构以及100-200bp长的上下游两端的侧翼序列。这种独一无二的特征便保证表达出来的pre-microRNA的生理活动尽可能接近天然状态。这种天然的结构便保证pre-microRNA与内源性microRNA合成机制相关的调节因子相互作用，引导pre-microRNA被正确的转运和剪切。下面为pre-microRNA表达载体插入序列示例（Fig.2）。  Fig.2 pre-microRNA（pre-let-7a-1）表达载体的构建示例。Panel1中列出的是整个插入序列。下划线所示的序列形成茎，斜体小写字母所示序列形成环。Panel 2给出了最终形成的茎环结构。 pre-microRNA表达载体构建技术服务流程： 1. 确定要表达的microRNA 查询microRNA序列及其基因背景序列。 2. 设计、合成pre-microRNA引物 根据载体序列和microRNA基因序列，设计合成相应的PCR引物。 3. PCR扩增 以基因组为模版，PCR扩增出microRNA基因序列。 4. 连接、转化和阳性克隆鉴定 将双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，并PCR和酶切鉴定 阳性克隆。 5. 准备质粒，菌株 柱抽提验证正确的质粒，定量。准备含有正确质粒的单克隆甘油菌株。 6. 产品包装，发货 提供克隆有目的microRNA序列的表达质粒，以及阴性对照质粒各一份。甘油保存菌株各一支。 附microRNA表达质粒的说明书，以及构建实验报告，包括载体构建过程，鉴定记录，测序报 告。 持续表达特定pre-microRNA的稳定细胞株可用于监测基因的蛋白表达情况以鉴定microRNA的靶基因。 康成生物包装表达载体产生慢病毒以获得稳定细胞株技术服务流程： 1. 使用QIAGEN去内毒素质粒纯化试剂盒将microRNA前体表达载体进行纯化 2. 使用慢病毒包装系统将纯化后的表达载体包装到假病毒颗粒中 3. 假病毒颗粒感染宿主细胞 4. 使用流式细胞仪根据copGFP标志筛选稳定细胞株，或者通过Zeocin抗性基因筛选稳定细胞株 |
9楼2008-08-13 13:12:10
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美季生物技术公司的资料
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原始地址http://www.majorbio.cn/jsfwInfo.asp?ID=10 MicroRNA 一. MicroRNA简介 MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。  二. MicroRNA形式 1. pre-miRNA 约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。 制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。 2. pri－miRNA 天然pri－miRNA 从染色体基因文库中调取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体），以强大的CMV启动子操纵该300bp－1000bp microRNA。 人工pri－miRNA 选择一个完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体）。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。  三. MicroRNA选择 ★pre-miRNA是最早采用的microRNA，拥有大量的成功报道。化学合成的pre-miRNA制备快捷，可以标记荧光等追踪。缺点是制备的RNA稳定性较差，而且，由于制备的microRNA较长，合成时RNA的错误难以避免（当合成RNA超过60bp时，出现一个碱基错误率约30％），转录制备的pre-miRNA稳定性较好，但无flank结构，很少使用。质粒载体形式的pre－miRNA也因为发现microRNA的flank对于microRNA功能和测定非常重要，现已逐渐被pri-miRNA取代。 ★人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好，也有足够多的成功使用的经验报道，但这种人工microRNA采用固定的mir155 flank，制备的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐渐较少使用。 ★原始天然pri-miRNA克隆自天然文库的microRNA由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是近来被首选方法。 ★pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以转染大多数绝细胞，产品质量可靠。缺点是腺病毒有一定的毒性，以往实验腺病毒毒性并未引起重视，但我们发现在microRNA实验中显得比较突出。另外，制备周期长，费用高也是不容忽视的缺点。 ★慢病毒microRNA：目前最好的microRNA实验产品，缺点是慢病毒自身的不足，即制备lenti－virus时，病毒的质量批间差异较大。 ★AAV、或retrovirus microRNA：与腺病毒和lenti－virus microRNA一样，具有病毒产品的优势与缺点。 四. MicroRNA产品 产品 制备方式 大小 Pri-microRNA 天然Pri-microRNA库 300－1000 bp 约500 bp 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 人工Pri-microRNA库/订制 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 Pre-microRNA 合成 约70bp 化学合成或生物转录 载体 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 1. pri－miRNA库 ★所有的pri-miRNA都是从人类基因组DNA中扩增出来的，其长度大约为300bp－1000bp。 ★microRNA完全忠实于细胞内的天然结构,具有更高的效率。 ★microRNA表达质粒载体，可以直接使用。microRNA转录结构单元已经构建到基于FIV的慢病毒载体，同时与晶赛公司的腺病毒系统完全兼容，方便制备病毒。 ★EGFP和miRNA在CMV启动子的引导下共表达。 ★microRNA质粒经过严格测序。 ★部分制备的microRNA质粒或病毒经过生物学测定，microRNA效果肯定与明确。 ★已经完成microRNA列表(部分)，请Email咨询查找其它的miRNA。 miRNA 名称 测序结果 miRNA大小 载体 生物学测定 1 hsa-mir-98 ok 562 B Ok 2 hsa-mir-96 ok 511 B Ok 3 hsa-mir-95 ok 495 B Ok 4 hsa-mir-17-92 ok 978 L Ok …… …… …… …… …… 513 hsa-mir-18a 序列错误 681 L Ok 514 hsa-mir-345 一个突变 548 L Ok 515 hsa-mir-589 Ok 620 L Ok 516 hsa-mir-219-2 Ok 610 L 517 hsa-mir-215 ok 458 L Ok 518 hsa-mir-212 一个突变 474 L Ok ...继续中 B：同时有质粒、慢病毒质粒载体和腺病毒质粒载体； L：仅有慢病毒载体。可根据要求改构到您希望的载体。 更多及详细microRNA情报请通过Email：genesil@genesil.com咨询。 更多新发现的microRNA请参见MiRBase：http://microrna.sanger.ac.uk/ [/url] 2. pri－miRNA或pre－miRNA载体/载体构建服务 ★晶赛公司有256个构建好的pre－miRNA。 ★pre-microRNA表达质粒构建 ①microRNA转录结构单元通过增强型Pol III 启动子（hU6, hH1, h7SK, mU6）引导pre-miRNA的过表达。 ②可选择带EGFP荧光标签。 ③终产品均经过严格测序。 ④载体类型：和siRNA一样，microRNA的效率只与“启动子－miRNA－终止信号”转录结构单元有关，因此任何质粒microRNA作用效果应该基本一致，质粒小一些对于细胞转染效率略有好处。晶赛公司的microRNA质粒与腺病毒、慢病毒系统完全兼容，许多表达载体已包装成腺病毒及慢病毒，有数十种载体可供选择，请[url=mailto:genesil@genesil.com]Email咨询载体情报。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。  ★pri－microRNA表达质粒 ①pre-microRNA＋mir155的microRNA两臂共同组成pri-microRNA。 质粒可用于直接制备基于FIV的慢病毒，并同时与晶赛公司的腺病毒系统完全兼容。 ②EGFP和miRNA在CMV启动子的引导下共表达。 ③终产品均经过严格测序。 ④载体类型：和siRNA一样，microRNA的效率只与“启动子－miRNA－终止信号”转录结构单元有关，因此任何质粒microRNA作用效果应该基本一致，质粒小一些对于细胞转染效率略有好处。晶赛公司的microRNA质粒与腺病毒、慢病毒系统完全兼容，许多表达载体已包装成腺病毒及慢病毒，有数十种载体可供选择，请Email咨询载体情报。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。 Pri-miRNA质粒示意图  3. 生物转录合成microRNA 产品形式为70bp左右的pre-microRNA。 生物合成的microRNA有较之化学合成的microRNA有更高的稳定性及效率。以晶赛专利的高保真RNA生物合成技术为基础的microRNA产品有着迄今最好的正确率，从而确保您实验的成功。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。 4. 化学合成的microRNA 产品形式为70bp左右的pre-microRNA。 化学合成非常快捷，您定购一周后就可以开始您的实验。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。 5. MicroRNA病毒载体 腺病毒MicroRNA 全部MicroRNA产品均能够以腺病毒形式提供。 慢病毒MicroRNA 提供慢病毒MicroRNA质粒、转染试剂、包装细胞，操作方法。您可以方便地自己制备慢病毒。 |
10楼2008-08-13 13:21:23