| 查看: 1382 | 回复: 15 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
三磷酸腺苷铁杆木虫 (职业作家)
|
[交流]
基于慢病毒的microRNA表达系统-交流转帖
|
||
|
未来一段时间可能想做一个miRNA的稳定转染 所以想找有没有现成的表达载体 自己包装的话挺麻烦的 搜了一下，国外的有Invitrogen、Thermo，国内的有康成（不过似乎也是跟外国公司挂钩的吧） 钱不是问题，要的是效果 不知道有没有人用过，觉得哪个公司好，交流一下～～～ ------------------------ 8.13 接到版主的奖励通知，呵呵，有点受宠若惊 在此把原来的帖子更名，作为交流专用帖 希望大家能够在这里多多发表，共同交流 比如，什么公司的产品可靠，包装时需要注意什么问题，会不会对哪些细胞产生明显的毒性等等 也不一定专限于miR，其他的基于慢病毒的siRNA表达系统问题也可以在此讨论 我跟Invitrogen要了一些资料，待会我整理完后再跟帖发上来 [ Last edited by 三磷酸腺苷 on 2008-8-13 at 09:28 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
请教限项目规定
已经有5人回复
-
拟解决的关键科学问题还要不要写
已经有8人回复
-
最失望的一年
已经有16人回复
-
存款400万可以在学校里躺平吗
已经有33人回复
-
求助一下有机合成大神
已经有3人回复
-
求推荐英文EI期刊
已经有5人回复
-
26申博
已经有3人回复
-
基金委咋了？2026年的指南还没有出来？
已经有10人回复
-
基金申报
已经有6人回复
-
疑惑？
已经有5人回复
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
- BioEPI: 3
- 应助: 1 (幼儿园)
- 贵宾: 0.021
- 金币: 7298.5
- 散金: 9
- 红花: 13
- 帖子: 4032
- 在线: 224.7小时
- 虫号: 551611
- 注册: 2008-04-27
- 性别: GG
- 专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受
美季生物技术公司的资料
★ ★ ★ ★
xyklmu(金币+4,VIP+0):thanks
xyklmu(金币+4,VIP+0):thanks
|
原始地址http://www.majorbio.cn/jsfwInfo.asp?ID=10 MicroRNA 一. MicroRNA简介 MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。  二. MicroRNA形式 1. pre-miRNA 约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。 制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。 2. pri－miRNA 天然pri－miRNA 从染色体基因文库中调取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体），以强大的CMV启动子操纵该300bp－1000bp microRNA。 人工pri－miRNA 选择一个完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体）。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。  三. MicroRNA选择 ★pre-miRNA是最早采用的microRNA，拥有大量的成功报道。化学合成的pre-miRNA制备快捷，可以标记荧光等追踪。缺点是制备的RNA稳定性较差，而且，由于制备的microRNA较长，合成时RNA的错误难以避免（当合成RNA超过60bp时，出现一个碱基错误率约30％），转录制备的pre-miRNA稳定性较好，但无flank结构，很少使用。质粒载体形式的pre－miRNA也因为发现microRNA的flank对于microRNA功能和测定非常重要，现已逐渐被pri-miRNA取代。 ★人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好，也有足够多的成功使用的经验报道，但这种人工microRNA采用固定的mir155 flank，制备的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐渐较少使用。 ★原始天然pri-miRNA克隆自天然文库的microRNA由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是近来被首选方法。 ★pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以转染大多数绝细胞，产品质量可靠。缺点是腺病毒有一定的毒性，以往实验腺病毒毒性并未引起重视，但我们发现在microRNA实验中显得比较突出。另外，制备周期长，费用高也是不容忽视的缺点。 ★慢病毒microRNA：目前最好的microRNA实验产品，缺点是慢病毒自身的不足，即制备lenti－virus时，病毒的质量批间差异较大。 ★AAV、或retrovirus microRNA：与腺病毒和lenti－virus microRNA一样，具有病毒产品的优势与缺点。 四. MicroRNA产品 产品 制备方式 大小 Pri-microRNA 天然Pri-microRNA库 300－1000 bp 约500 bp 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 人工Pri-microRNA库/订制 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 Pre-microRNA 合成 约70bp 化学合成或生物转录 载体 质粒载体 病毒：腺病毒/慢病毒 1. pri－miRNA库 ★所有的pri-miRNA都是从人类基因组DNA中扩增出来的，其长度大约为300bp－1000bp。 ★microRNA完全忠实于细胞内的天然结构,具有更高的效率。 ★microRNA表达质粒载体，可以直接使用。microRNA转录结构单元已经构建到基于FIV的慢病毒载体，同时与晶赛公司的腺病毒系统完全兼容，方便制备病毒。 ★EGFP和miRNA在CMV启动子的引导下共表达。 ★microRNA质粒经过严格测序。 ★部分制备的microRNA质粒或病毒经过生物学测定，microRNA效果肯定与明确。 ★已经完成microRNA列表(部分)，请Email咨询查找其它的miRNA。 miRNA 名称 测序结果 miRNA大小 载体 生物学测定 1 hsa-mir-98 ok 562 B Ok 2 hsa-mir-96 ok 511 B Ok 3 hsa-mir-95 ok 495 B Ok 4 hsa-mir-17-92 ok 978 L Ok …… …… …… …… …… 513 hsa-mir-18a 序列错误 681 L Ok 514 hsa-mir-345 一个突变 548 L Ok 515 hsa-mir-589 Ok 620 L Ok 516 hsa-mir-219-2 Ok 610 L 517 hsa-mir-215 ok 458 L Ok 518 hsa-mir-212 一个突变 474 L Ok ...继续中 B：同时有质粒、慢病毒质粒载体和腺病毒质粒载体； L：仅有慢病毒载体。可根据要求改构到您希望的载体。 更多及详细microRNA情报请通过Email：genesil@genesil.com咨询。 更多新发现的microRNA请参见MiRBase：http://microrna.sanger.ac.uk/ [/url] 2. pri－miRNA或pre－miRNA载体/载体构建服务 ★晶赛公司有256个构建好的pre－miRNA。 ★pre-microRNA表达质粒构建 ①microRNA转录结构单元通过增强型Pol III 启动子（hU6, hH1, h7SK, mU6）引导pre-miRNA的过表达。 ②可选择带EGFP荧光标签。 ③终产品均经过严格测序。 ④载体类型：和siRNA一样，microRNA的效率只与“启动子－miRNA－终止信号”转录结构单元有关，因此任何质粒microRNA作用效果应该基本一致，质粒小一些对于细胞转染效率略有好处。晶赛公司的microRNA质粒与腺病毒、慢病毒系统完全兼容，许多表达载体已包装成腺病毒及慢病毒，有数十种载体可供选择，请[url=mailto:genesil@genesil.com]Email咨询载体情报。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。  ★pri－microRNA表达质粒 ①pre-microRNA＋mir155的microRNA两臂共同组成pri-microRNA。 质粒可用于直接制备基于FIV的慢病毒，并同时与晶赛公司的腺病毒系统完全兼容。 ②EGFP和miRNA在CMV启动子的引导下共表达。 ③终产品均经过严格测序。 ④载体类型：和siRNA一样，microRNA的效率只与“启动子－miRNA－终止信号”转录结构单元有关，因此任何质粒microRNA作用效果应该基本一致，质粒小一些对于细胞转染效率略有好处。晶赛公司的microRNA质粒与腺病毒、慢病毒系统完全兼容，许多表达载体已包装成腺病毒及慢病毒，有数十种载体可供选择，请Email咨询载体情报。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。 Pri-miRNA质粒示意图  3. 生物转录合成microRNA 产品形式为70bp左右的pre-microRNA。 生物合成的microRNA有较之化学合成的microRNA有更高的稳定性及效率。以晶赛专利的高保真RNA生物合成技术为基础的microRNA产品有着迄今最好的正确率，从而确保您实验的成功。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。 4. 化学合成的microRNA 产品形式为70bp左右的pre-microRNA。 化学合成非常快捷，您定购一周后就可以开始您的实验。这种pre－microRNA存在不足，请参考MicroRNA简介中有关部分。 5. MicroRNA病毒载体 腺病毒MicroRNA 全部MicroRNA产品均能够以腺病毒形式提供。 慢病毒MicroRNA 提供慢病毒MicroRNA质粒、转染试剂、包装细胞，操作方法。您可以方便地自己制备慢病毒。 |
10楼2008-08-13 13:21:23
2楼2008-08-11 14:25:47
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
- BioEPI: 3
- 应助: 1 (幼儿园)
- 贵宾: 0.021
- 金币: 7298.5
- 散金: 9
- 红花: 13
- 帖子: 4032
- 在线: 224.7小时
- 虫号: 551611
- 注册: 2008-04-27
- 性别: GG
- 专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受
3楼2008-08-11 23:23:23
4楼2008-08-12 09:56:32