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三磷酸腺苷铁杆木虫 (职业作家)
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[交流]
基于慢病毒的microRNA表达系统-交流转帖
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未来一段时间可能想做一个miRNA的稳定转染 所以想找有没有现成的表达载体 自己包装的话挺麻烦的 搜了一下，国外的有Invitrogen、Thermo，国内的有康成（不过似乎也是跟外国公司挂钩的吧） 钱不是问题，要的是效果 不知道有没有人用过，觉得哪个公司好，交流一下～～～ ------------------------ 8.13 接到版主的奖励通知，呵呵，有点受宠若惊 在此把原来的帖子更名，作为交流专用帖 希望大家能够在这里多多发表，共同交流 比如，什么公司的产品可靠，包装时需要注意什么问题，会不会对哪些细胞产生明显的毒性等等 也不一定专限于miR，其他的基于慢病毒的siRNA表达系统问题也可以在此讨论 我跟Invitrogen要了一些资料，待会我整理完后再跟帖发上来 [ Last edited by 三磷酸腺苷 on 2008-8-13 at 09:28 ] |
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三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
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这个是国内康成生物的资料~~~
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xyklmu(金币+4,VIP+0):thanks
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使用慢病毒表达系统pre-microRNA载体构建技术服务 使用慢病毒系统构建pre-microRNA载体，保证pre-microRNA和内源性microRNA合成机的相关的调节因子相互作用，有利于pre-microRNA在运输蛋白作用下从细胞核进入细胞质，并在Dicer等相关蛋白作用下，剪切得到成熟microRNA从而发挥生物学作用。使用慢病毒表达系统还可将pre-microRNA表达载体转染到难转染的细胞中；并且促进pre-microRNA整合到宿主细胞基因组中，有利于筛选稳转细胞株，稳定地降低靶基因的表达。 pre-microRNA表达载体的特点 1、多顺反子模式的设计简化了对转染细胞的鉴定 pre-microRNA表达载体表达多顺反子转录本，包含copGFP荧光标志、Zeocin抗性基因和 pre-microRNA（Fig.1）。这种设计简化了对表达pre-microRNA的细胞的鉴定和富集。  Pre-microRNA expressing vector Fig1 pre-microRNA表达载体结构图 2、RNA聚合酶Ⅱ启动子保证了从单拷贝的整合子强烈表达pre-microRNA 表达非常短的siRNA和shRNA通常使用pol-Ⅲ启动子，而使用pol-Ⅱ启动子更能有效表达 microRNA初级转录本（Stegmeier,2005）。pre-microRNA表达载体使用CMV启动子启动 表达pre-microRNA（Fig.1）。CMV启动子具有强启动子活性保证了从单拷贝整合子高水平的 表达pre-microRNA。 3、慢病毒表达系统有利于载体转染及整合 将pre-microRNA分子克隆到基于慢病毒的载体上，和其他标准质粒载体一样， pre- microRNA表达载体通过传统的转染方法转染到细胞中能够瞬时表达pre-microRNA。更重要的 是，由于含有编码病毒核心蛋白的基因，该表达载体可以被包装到假病毒颗粒中，将载体转染到 难转染的细胞株中，如原代细胞、干细胞及不分化细胞等；而且插入片段（pre-microRNA）整 合到宿主细胞基因组中的几率大大增加，有利于筛选获得持续表达pre-microRNA的稳定细胞 株。microRNA被认为参与各种细胞信号途径，因此特异性表达microRNA的稳定细胞株便可作 为一种将microRNA和生物学功能联系到一起的独特的研究工具。 插入序列的特点：从天然的基因组序列中表达pre-microRNA转录本 构建pre-microRNA表达载体时的插入序列不仅包含Sanger’ miRBase数据库中列出的成熟体microRNA的序列，还包含茎环结构以及100-200bp长的上下游两端的侧翼序列。这种独一无二的特征便保证表达出来的pre-microRNA的生理活动尽可能接近天然状态。这种天然的结构便保证pre-microRNA与内源性microRNA合成机制相关的调节因子相互作用，引导pre-microRNA被正确的转运和剪切。下面为pre-microRNA表达载体插入序列示例（Fig.2）。  Fig.2 pre-microRNA（pre-let-7a-1）表达载体的构建示例。Panel1中列出的是整个插入序列。下划线所示的序列形成茎，斜体小写字母所示序列形成环。Panel 2给出了最终形成的茎环结构。 pre-microRNA表达载体构建技术服务流程： 1. 确定要表达的microRNA 查询microRNA序列及其基因背景序列。 2. 设计、合成pre-microRNA引物 根据载体序列和microRNA基因序列，设计合成相应的PCR引物。 3. PCR扩增 以基因组为模版，PCR扩增出microRNA基因序列。 4. 连接、转化和阳性克隆鉴定 将双酶切的PCR产物连接到同样双酶切的表达载体中，转化大肠杆菌DH5α，并PCR和酶切鉴定 阳性克隆。 5. 准备质粒，菌株 柱抽提验证正确的质粒，定量。准备含有正确质粒的单克隆甘油菌株。 6. 产品包装，发货 提供克隆有目的microRNA序列的表达质粒，以及阴性对照质粒各一份。甘油保存菌株各一支。 附microRNA表达质粒的说明书，以及构建实验报告，包括载体构建过程，鉴定记录，测序报 告。 持续表达特定pre-microRNA的稳定细胞株可用于监测基因的蛋白表达情况以鉴定microRNA的靶基因。 康成生物包装表达载体产生慢病毒以获得稳定细胞株技术服务流程： 1. 使用QIAGEN去内毒素质粒纯化试剂盒将microRNA前体表达载体进行纯化 2. 使用慢病毒包装系统将纯化后的表达载体包装到假病毒颗粒中 3. 假病毒颗粒感染宿主细胞 4. 使用流式细胞仪根据copGFP标志筛选稳定细胞株，或者通过Zeocin抗性基因筛选稳定细胞株 |
9楼2008-08-13 13:12:10
2楼2008-08-11 14:25:47
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
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