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T载连不上！
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| 我的目的片段1630bp，开始扩增目的片段时，第一次用PrimeStar没结果，第二次用KOD有结果，加A尾后成功连T3，测序后结果完全不对，且只测出一端酶切位点，第三次用Hifi有结果，但一直未连上T载，操作步骤完全按照说明书，PCR产物和T3各1μL，水3μL，冰浴30min，42度热激30s，冰上2min，加250μLYEB，37度200转1h，后涂含羧苄的平板，过夜后平板不长菌，已经连了3次了，都是不长菌。PCR产物是胶回收后才连T载的，也尝试过更换感受态（确定未过期）和T3，但都是不长菌。我不理解的是，T3本身也有氨苄抗性，就算是没有连上目的片段是不是也会长的呀？另外如果再连不上的话该怎么办，可否尝试直接连表达载体。请各位指教！万分感谢！！ |
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