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cassie小萍

新虫 (小有名气)

[求助] 我的酶完全挂不上Ni柱了,组氨酸都在,可能是什么原因?怎么解决 已有1人参与

我的酶以前是可以用Ni柱纯化的,但最近完全挂不上柱了,为什么呢?构建序列时我是在C端又加了6个his,重新测序组氨酸都在,可能是什么原因?怎么解决呢
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cassie小萍

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenyuanli at 2015-07-22 21:49:13
完全不挂柱,是因为NI离子与带His标签的目标蛋白之间没有结合能力,从以下几个方面考虑一下试试看,ni柱再生一下或者更换新填料试试(可以尝试用Cu2+柱,结合能力强于Ni2+)、带咪唑的缓冲液是否有问题?酶表达出来 ...

另请问WB怎么做?
5楼2015-07-23 21:02:39
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查看全部 8 个回答

chenyuanli

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cassie小萍: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-23 10:03:54
完全不挂柱,是因为NI离子与带His标签的目标蛋白之间没有结合能力,从以下几个方面考虑一下试试看,ni柱再生一下或者更换新填料试试(可以尝试用Cu2+柱,结合能力强于Ni2+)、带咪唑的缓冲液是否有问题?酶表达出来后组氨酸标签是否还在?可以做个WB试试。

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嘻哈哈
2楼2015-07-22 21:49:13
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shaylynlx

新虫 (初入文坛)

向你推荐Cube Biotech 的蛋白纯化介质PureCube Ni-NTA Agarose,结合能力超高,纯化率达70%!
3楼2015-07-23 14:53:18
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cassie小萍

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chenyuanli at 2015-07-22 21:49:13
完全不挂柱,是因为NI离子与带His标签的目标蛋白之间没有结合能力,从以下几个方面考虑一下试试看,ni柱再生一下或者更换新填料试试(可以尝试用Cu2+柱,结合能力强于Ni2+)、带咪唑的缓冲液是否有问题?酶表达出来 ...

Lysis buffer: 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM 咪唑
Wash buffer: 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,20 mM 咪唑
Elution buffer: 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,250 mM 咪唑
请问缓冲液哪里会有问题?
4楼2015-07-23 15:31:32
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