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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 我的酶完全挂不上Ni柱了，组氨酸都在，可能是什么原因？怎么解决
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cassie小萍

新虫 (小有名气)

[求助] 我的酶完全挂不上Ni柱了，组氨酸都在，可能是什么原因？怎么解决 已有1人参与

我的酶以前是可以用Ni柱纯化的，但最近完全挂不上柱了，为什么呢？构建序列时我是在C端又加了6个his，重新测序组氨酸都在，可能是什么原因？怎么解决呢
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1楼 2015-07-22 19:37:41
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chenyuanli

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cassie小萍: 金币+20, ★★★★★最佳答案 2015-07-23 10:03:54
完全不挂柱，是因为NI离子与带His标签的目标蛋白之间没有结合能力，从以下几个方面考虑一下试试看，ni柱再生一下或者更换新填料试试（可以尝试用Cu2+柱，结合能力强于Ni2+）、带咪唑的缓冲液是否有问题？酶表达出来后组氨酸标签是否还在？可以做个WB试试。
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cassie小萍
嘻哈哈
2楼2015-07-22 21:49:13
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shaylynlx

新虫 (初入文坛)
向你推荐Cube Biotech 的蛋白纯化介质PureCube Ni-NTA Agarose，结合能力超高，纯化率达70%！
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3楼2015-07-23 14:53:18
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cassie小萍

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenyuanli at 2015-07-22 21:49:13
完全不挂柱，是因为NI离子与带His标签的目标蛋白之间没有结合能力，从以下几个方面考虑一下试试看，ni柱再生一下或者更换新填料试试（可以尝试用Cu2+柱，结合能力强于Ni2+）、带咪唑的缓冲液是否有问题？酶表达出来 ...

Lysis buffer: 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM 咪唑
Wash buffer: 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,20 mM 咪唑
Elution buffer: 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,250 mM 咪唑
请问缓冲液哪里会有问题？
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4楼2015-07-23 15:31:32
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cassie小萍

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenyuanli at 2015-07-22 21:49:13
完全不挂柱，是因为NI离子与带His标签的目标蛋白之间没有结合能力，从以下几个方面考虑一下试试看，ni柱再生一下或者更换新填料试试（可以尝试用Cu2+柱，结合能力强于Ni2+）、带咪唑的缓冲液是否有问题？酶表达出来 ...

另请问WB怎么做？
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5楼2015-07-23 21:02:39
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flyingsky305

新虫 (小有名气)
将柱子重生一下再过柱。另外不可以N端和C端同时有His tag，否则可能不挂柱

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-07-26 08:46:38
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chenyuanli

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by flyingsky305 at 2015-07-26 08:46:38
将柱子重生一下再过柱。另外不可以N端和C端同时有His tag，否则可能不挂柱

为什么？
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嘻哈哈
7楼2015-07-27 11:09:39
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flyingsky305

新虫 (小有名气)
经验啊。另外有些蛋白自身序列中有His tag，最好表达时不用his tag纯化

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2015-07-28 12:12:50
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