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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 关于利用pCAMBIA1301构建超表达载体
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晓颗

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于利用pCAMBIA1301构建超表达载体 已有1人参与

最近要利用pCAMBIA1301构建超表达载体，这个载体是我直接在生物公司买的，我不知道应该把我的目的基因插到哪个酶切位点，我的目的基因里面有起始密码子和终止密码子，如果利用Nco l和Bgl l双酶切，好像会把GUS的第一外显子切掉 对于我之后检测有影响吗，插到多克隆位点区，两个启动子好像都启动不了，请问各位大神们 我应该怎么弄啊？？？

关于利用pCAMBIA1301构建超表达载体
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1楼 2015-07-20 10:53:41
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晓颗

新虫 (初入文坛)
有没有人呐 顶上去。。。
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2楼2015-07-20 15:09:21
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晓颗

新虫 (初入文坛)
有没有人呢 来指导我一下 做实验真的很不顺利啊 各种问题。。。。我准备用自带启动子和终止子的中间载体导入多克隆位点，也就是MCS区，但是确定酶切位点的时候发现好几个常用位点序列我的目的基因都有啊，根本切不了，我头都大了！！！！
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3楼2015-07-21 21:10:38
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天秤座的女孩

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晓颗 at 2015-07-21 21:10:38
有没有人呢 来指导我一下 做实验真的很不顺利啊 各种问题。。。。我准备用自带启动子和终止子的中间载体导入多克隆位点，也就是MCS区，但是确定酶切位点的时候发现好几个常用位点序列我的目的基因都有啊，根本切不了 ...

必要的时候，你可以把目的基因内部的位点序列 用突变试剂盒突变掉。在下游的Nhe I(2014)和Pml I那里可以切吗？
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4楼2015-08-18 19:16:47
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602059625

金虫 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晓颗 at 2015-07-21 21:10:38
有没有人呢 来指导我一下 做实验真的很不顺利啊 各种问题。。。。我准备用自带启动子和终止子的中间载体导入多克隆位点，也就是MCS区，但是确定酶切位点的时候发现好几个常用位点序列我的目的基因都有啊，根本切不了 ...

酶切避开就用infusion之类的连

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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[url=http://ip.WoTuLa.com][img]http://i.WoTuLa.com/note.png?name=填写姓名&say=这里填写您想说的内容。[/img][/url]
5楼2015-08-19 00:30:14
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cilia54007

新虫 (著名写手)
如果用Nco l和Bgl l双酶切，后插入目的片段的ORF，这个不能做吗？是对GUS有影响，还是说目的片段不表达呢？
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6楼2017-04-02 07:18:24
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七

【答案】应助回帖

没有合适的酶切位点或者酶切连接效率不好，考虑同源重组。
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与人玫瑰手有余香
7楼2017-04-02 21:37:52
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cilia54007

新虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 路人甲007 at 2017-04-02 21:37:52
没有合适的酶切位点或者酶切连接效率不好，考虑同源重组。

那么请问，具体应该如何去做呢？
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8楼2017-04-03 15:29:10
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