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444565008qq

新虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量pcr 已有3人参与

马上要做荧光定量pcr,我都应该准备什么,提前做什么预实验,还有扩增效率是什么意思,新手,不懂,请指点。
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fay0427

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
444565008qq: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-07-17 12:56:04
我最近也在准备做荧光定量PCR,查了很多的相关资料~不知道你的具体情况是什么,按照我的来说应该是准备样品提取RNA-反转录为cDNA-再开始荧光定量,你所说的扩增效率是通过梯度稀释试验获得的,因为只有在一定范围内的扩增效率才是有效的,建议你多看看关于荧光定量PCR的基础知识,希望有所帮助
加油!
2楼2015-07-16 15:08:34
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vivd娟

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
444565008qq: 金币+5 2015-07-17 12:56:16
准备的东西不少,如果是要直接买试剂盒的话,什么都方便了
3楼2015-07-16 16:57:25
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444565008qq

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fay0427 at 2015-07-16 15:08:34
我最近也在准备做荧光定量PCR,查了很多的相关资料~不知道你的具体情况是什么,按照我的来说应该是准备样品提取RNA-反转录为cDNA-再开始荧光定量,你所说的扩增效率是通过梯度稀释试验获得的,因为只有在一定范围内 ...

谢谢
4楼2015-07-17 12:55:42
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444565008qq

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fay0427 at 2015-07-16 15:08:34
我最近也在准备做荧光定量PCR,查了很多的相关资料~不知道你的具体情况是什么,按照我的来说应该是准备样品提取RNA-反转录为cDNA-再开始荧光定量,你所说的扩增效率是通过梯度稀释试验获得的,因为只有在一定范围内 ...

反转录做完了,就是不太知道荧光怎么做, 谢谢,我会多看看资料
5楼2015-07-17 12:57:27
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q120465872

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
444565008qq: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-10-08 13:50:34
最好先拿几个样做下预实验确定下条件。引物质量和片段大小这些都要自己心里有底,然后根据试剂盒提供的参考条件优化自己的实验。
扩增效率通过梯度稀释模板计算,越接近100%肯定越好,上下一定范围则根据具体情况确定(如具体微生物类群定量这种,对扩增效率要求非常低,80%多都被认可,但是具体某个基因表达量差异这种,要求相对高一些)。
赐予我力量,去改变我所能改变的;赐予我勇气,去接受我所不能改变的;并赐予我智慧,去分辨这两者。
6楼2015-10-08 10:23:16
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