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木虫 (小有名气)

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虫号: 1033236
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专业: 生物化学

[求助] 鼠胚成纤维细胞分离

各位虫友，最近在分离鼠胚成纤维细胞MEF，分离细胞没问题，但是总没有我想要的基因型。
背景：A/a （Het型）♂ * A/a （Het）♀，符合孟德尔遗传定律，其中a/a在出生后几小时内死亡（的确观察到，并检测到a/a）。
目的：a/a 纯合动物个体不可得，无法进行动物实验，因此分离a/a型MEF细胞，补充一下细胞实验。
结果：分离了5、6次接近50个胚胎，没有一个a/a基因型细胞，但是有A/A。
步骤：
1、短颈处死小鼠，酒精消毒，碘酊消毒，酒精脱碘；
2、打开腹腔，镊子夹住子宫颈，提起子宫，剪除韧带等取出子宫；
3、子宫浸泡于PBS，整体清洗3遍；
4、剪开子宫，将胚胎浸泡于PBS中，总体清洗2遍。将每个胚胎分别置于细胞培养皿中（含PBS）；
5、每个胚胎清洗3遍，每次浸泡约3min，剪刀镊子独立；
6、去除胚胎内脏、四肢、头部，胚体用5ml PBS冲了一遍；
7、组织置于1.5ml EP管中，剪碎。加入1.3ml胰酶，37度消化30min，期间定时混匀；
8、终止消化，反复吹打消化液，接种于10cm 培养皿；
9、2-3h后换液；
10、用6中的头部组织提起DNA，进行基因型检测。

各位虫友，我想我一定是忽略了某个细节，请用力敲醒我吧