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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 克隆问题
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zgnykxylssdh

铁虫 (初入文坛)

[求助] 克隆问题 已有3人参与

我的目的片段2900bp，用PCR扩增后非常亮，将PCR产物酶切XhoI 和Bsal，是先用Xhol，而后用Bsal酶切的；
载体也是同样的方法酶切，即先用XhoI而后用BsaI酶切的。
载体和目的片段酶切回收后，都经电泳鉴定，都为单一的一条带，大小合适，无杂带。
载体和目的片段连接，转化（转化所用感受态为DH5a），克隆，筛选阳性，一直筛选不出来。
后来，筛出两个克隆，但经测序后，目的片段反向插入，并且目的片段部分插入
请问这是什么原因造成的？急急急！
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1楼 2015-07-09 09:51:04
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的片段上有没有这两个酶的酶切位点，应该是有，从而造成片段连接而不是整体连接。
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2楼2015-07-09 10:52:00
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zgnykxylssdh

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-07-09 10:52:00
目的片段上有没有这两个酶的酶切位点，应该是有，从而造成片段连接而不是整体连接。

片段酶切回收后跑了一下核酸电泳，片段是2900bp，并没有断裂或者杂带啊
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3楼2015-07-09 11:01:50
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zgnykxylssdh

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-07-09 10:52:00
目的片段上有没有这两个酶的酶切位点，应该是有，从而造成片段连接而不是整体连接。

片段上没有上面两个酶切位点，片段酶切正常（也没有切下来杂带）
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4楼2015-07-09 11:35:21
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wsad5213

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我之前克隆基因在连接转化的步骤经常出现菌落PCR是非阳性PCR，最后实在没有办法，我就直接将扩增的目的片段产物PCR送去测序，结果很棒，并且比对成功了，如果你实在找不到原因，可以试试直接送去测序
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5楼2015-07-09 16:20:17
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erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是你自己把上下游的酶切位点弄反了？
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6楼2015-07-09 21:27:09
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Look_2014

金虫 (小有名气)
是不是把载体图看错了？载体图上左边的酶切位点不一定是在上游，右边的不一定是在下游

[ 发自小木虫客户端 ]
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Look
7楼2015-07-10 08:26:13
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zgnykxylssdh

铁虫 (初入文坛)
载体片段酶切位点，引物都查过了，都没有问题
会不会存在片段在大肠杆菌里自身断裂的问题
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8楼2015-08-06 18:25:31
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