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zgnykxylssdh

铁虫 (初入文坛)

[求助] 克隆问题已有3人参与

我的目的片段2900bp,用PCR扩增后非常亮,将PCR产物酶切XhoI 和Bsal,是先用Xhol,而后用Bsal酶切的;
载体也是同样的方法酶切,即先用XhoI而后用BsaI酶切的。
载体和目的片段酶切回收后,都经电泳鉴定,都为单一的一条带,大小合适,无杂带。
载体和目的片段连接,转化(转化所用感受态为DH5a),克隆,筛选阳性,一直筛选不出来。
后来,筛出两个克隆,但经测序后,目的片段反向插入,并且目的片段部分插入
请问这是什么原因造成的?急急急!
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
目的片段上有没有这两个酶的酶切位点,应该是有,从而造成片段连接而不是整体连接。
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2楼2015-07-09 10:52:00
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zgnykxylssdh

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-07-09 10:52:00
目的片段上有没有这两个酶的酶切位点,应该是有,从而造成片段连接而不是整体连接。

片段酶切回收后跑了一下核酸电泳,片段是2900bp,并没有断裂或者杂带啊
3楼2015-07-09 11:01:50
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zgnykxylssdh

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jiqinger at 2015-07-09 10:52:00
目的片段上有没有这两个酶的酶切位点,应该是有,从而造成片段连接而不是整体连接。

片段上没有上面两个酶切位点,片段酶切正常(也没有切下来杂带)
4楼2015-07-09 11:35:21
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wsad5213

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我之前克隆基因在连接转化的步骤经常出现菌落PCR是非阳性PCR,最后实在没有办法,我就直接将扩增的目的片段产物PCR送去测序,结果很棒,并且比对成功了,如果你实在找不到原因,可以试试直接送去测序
5楼2015-07-09 16:20:17
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erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
会不会是你自己把上下游的酶切位点弄反了?
6楼2015-07-09 21:27:09
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Look_2014

金虫 (小有名气)

是不是把载体图看错了?载体图上左边的酶切位点不一定是在上游,右边的不一定是在下游

[ 发自小木虫客户端 ]
Look
7楼2015-07-10 08:26:13
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zgnykxylssdh

铁虫 (初入文坛)

载体片段酶切位点,引物都查过了,都没有问题
会不会存在片段在大肠杆菌里自身断裂的问题
8楼2015-08-06 18:25:31
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