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我是传奇456

金虫 (正式写手)

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[求助] SDS-PAGE条带完全不清晰，求助！已有4人参与

RT，几次SDS-PAGE跑完后，染色都是这个样子，之前用G250快染也是，这次用的R250染了一夜也是这样，都是条带上部分拖的特别严重，所有蛋白条带基本都看不清。。
求助啊！

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1楼 2015-06-11 16:23:38

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

9楼: Originally posted by 我是传奇456 at 2015-06-12 12:25:15
5X的loading buffer，上样量大概20微左右，煮了5min，冰上5min，又煮了5min....

1.煮沸后是否经过高速离心？比如12000rpm 10分钟？
2.虽然很多朋友针对LZ的问题提出了可能的原因，很多原因确实会导致条带的堆积与弥散，虽然点样量确实存在过大的问题，但是从带型上看，我还是倾向于LZ的PAGE问题出自你的样品本身。我猜测一下LZ的样品应该是多聚氨基酸类（比如聚谷氨酸）或者其衍生物吧，如果确实是此类样品，我认为LZ的PAGE出现此类带型是完全正常的。减小点样量就可以了，无需做其他优化，此图就可以反映真实情况~

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大家相互帮助哈

13楼2015-06-13 01:27:40

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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我是传奇456: 金币+4, ★★★很有帮助, 多谢！ 2015-06-12 12:23:33

一、SDS PAGE电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施
1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100μL。
2.原因二：样品溶解不完全。
对策：
（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白表达样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。

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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！

2楼2015-06-11 16:51:00

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