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zhuwenjuan1

新虫 (初入文坛)

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虫号: 2752005
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专业: 生物化学

[求助] 噬菌斑测量病毒滴度已有1人参与

有哪位高手做过噬菌斑测量病毒滴度实验的，我没做过这个遇到几个问题，想请高手帮我指点指点。
用噬菌斑法测定病毒滴度。实验步骤如下：
1.无菌条件下，2 mL/孔细胞（5×105 cells/mL）种入6孔板，室温孵育1 h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度。
2.将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解，空100 mL无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热。
3.将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10-1~10-8，
4.弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1mL/孔，复孔，室温孵育1 h。
5.配置上层琼脂：加20 mL高温灭活FBS到2×Grace 100 mL，25 mL 2×Grace（含FBS）+12.5 mL 无菌水+12.5 mL 4% agarose geL，至预热的100 mL无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用。
6.弃6孔板内上清，快速加2 mL上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20 min使其凝固。将6孔板放入27℃培养箱，培养4天。
7.配制1 mg/mL中性红溶液，在Grace完全培养基中，无菌过滤。
8. 1.5 mL的上述溶液，16.5 mL Grace完全培养基，6 mL 4%的琼脂配制成中性红上层琼脂。
9.在病毒感染4天后，加1 mL中性红上层琼脂。
10.继续放到培养箱中，4~5天后即可观察噬菌斑，计数噬菌斑的数量，求得病毒滴度。
在实验过程中，在第6步时，琼脂一直处于半凝固状态，等到培养4天加中性红的时候，会和第一次的琼脂混合，达不到分层的效果，这是为什么？我们用的琼脂是高熔点的，在35℃以上才会溶解，室温在27℃左右。希望有做过的虫友帮忙解答一下，不胜感激！

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