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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 纯化蛋白
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洛雪画圈

新虫 (初入文坛)

[求助] 纯化蛋白 已有4人参与

不加His标签的蛋白如何纯化呀？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2015-06-02 10:31:50
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sdhxwp

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
体积排阻色谱，没his只能靠大小了吧

[ 发自小木虫客户端 ]
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卧看满天云不动，一抹长风万里空。
2楼2015-06-02 11:08:30
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洛雪画圈

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sdhxwp at 2015-06-02 11:08:30
体积排阻色谱，没his只能靠大小了吧

能得到比较纯的蛋白吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2015-06-02 12:27:44
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
前期、中期和后期都可以用分子筛，后期可以用亲和层析（用目的蛋白质的单克隆抗体），前期一般可以在处理之后用离子交换层析。你的问题不具体。要和我继续讨论请具体提问。
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4楼2015-06-02 12:39:44
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个方法就多了，his只是针对Ni的亲和纯化，可以根据表达蛋白的其他性质选用其他亲和纯化，或是分子筛，以及离子交换等等
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
5楼2015-06-02 13:17:02
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shengulanhua

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-02 12:39:44
前期、中期和后期都可以用分子筛，后期可以用亲和层析（用目的蛋白质的单克隆抗体），前期一般可以在处理之后用离子交换层析。你的问题不具体。要和我继续讨论请具体提问。

请教一下，我是初次上凝胶柱，现在遇到问题是靠自由流速，里面会有气泡，在上柱子之前已经将凝胶真空抽过，还有就是凝胶多次用过，这一次上的还可以，想二次继续上样可以直接上样吗？柱子可以长期不拆，用防腐剂浸泡封存上吗？
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芝兰生于幽谷，不以无人而不芳
6楼2015-06-02 13:39:19
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by shengulanhua at 2015-06-02 13:39:19
请教一下，我是初次上凝胶柱，现在遇到问题是靠自由流速，里面会有气泡，在上柱子之前已经将凝胶真空抽过，还有就是凝胶多次用过，这一次上的还可以，想二次继续上样可以直接上样吗？柱子可以长期不拆，用防腐剂浸 ...

柱内有气泡时，有人说可以用手指轻轻谈几下柱子，其实这一般解决不了什么问题。
最直接的方法是让缓冲溶液过几次柱子，同时兼做一下层析柱的介质的平衡。一般可以用20mmol/L的PB，200mmol/L的NaCl，pH=7.0，用5-10个柱体积过柱，冲洗时可观测层析柱的检测器的基线是否平稳，这样一般也就能把柱内的气泡赶走了。如果这样都不能赶走柱体内的介质的气泡，那么就只能重新装柱了，绝对不能带着气泡就上样过柱了。
一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。洗脱完毕后，再用3到5个柱体积的缓冲溶液洗涤柱子即可。如果怀疑柱子中有残留的杂蛋白质和其他杂质，可以用0.2mol/L 或 NaOH1mol/L去除杂质，再用双蒸馏水平衡。对于粘附在柱上特别牢固的蛋白质可以用2%的蛋白酶溶液处理。
柱子的介质可以装在层析柱里，以供下次使用，问题不大。
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7楼2015-06-05 10:15:12
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