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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于巢氏PCR
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shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白

[交流] 关于巢氏PCR

今天扩增ND4ND5基因，大概4kb左右，电泳检测没有带，老师说通常情况也是这样滴。
我继续扩增基因片段，但是扩增了一个基因片段，电泳检测发现竟然一片黑暗，啥都米有，连引物二聚体都米有。
明天打算再试试，试试体系和条件，哪位虫子有此类经验的，拜求交流^_^
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1楼 2008-07-21 22:00:08
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by shellyliu at 2008-7-22 02:44:

扩增长片段时，我用延伸温度也是68°，7min
退火温度55°，只用了5s，请问你的退火温度和时间是怎么样的呀？

退火温度根据你的引物,你可以做几个梯度.退火时间一般是30s或者45s.你的5s太短了
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6楼2008-07-22 17:27:01
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查看全部 7 个回答

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):谢谢，继续帮忙啊
这么长的片段，汗……
一定要用适合long PCR的酶
如Takara的LA Taq
另外，预变性的时间要够长，才能充分打开模板的二级结构，必要时需要添加DMSO（需要摸浓度，太低太高都出不来。可以从体积比5%开始摸）
按照经验，1kb是1min的聚合时间，但你的片段这么长，就不知道能不能简单地按照这样线性地来算了
建议看看其他人是怎么做long PCR的
赞一下(10人) 回复此楼
2楼2008-07-21 22:59:39
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):呵呵，谢谢。继续探讨啊
我现在多用promega的gotaq，扩4-6kb没问题。差不多也是按照1kb/min，延伸温度68度。
扩增长片断可以考虑roche的expand and long taq我用的也可以
赞一下(10人) 回复此楼
3楼2008-07-22 05:39:02
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shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2008-7-21 22:59:
这么长的片段，汗……
一定要用适合long PCR的酶
如Takara的LA Taq
另外，预变性的时间要够长，才能充分打开模板的二级结构，必要时需要添加DMSO（需要摸浓度，太低太高都出不来。可以从体积比5%开始摸）
按照 ...

我用的酶是Chimerx的Taq DNA Polymerase，据说是比较好的酶哦，我也是第一次用这个酶~
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我就是玉树临风胜潘安，一朵梨花压海棠的×××
4楼2008-07-22 09:42:45
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