应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于巢氏PCR
71/1返回列表
查看: 586  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白

[交流] 关于巢氏PCR

今天扩增ND4ND5基因，大概4kb左右，电泳检测没有带，老师说通常情况也是这样滴。
我继续扩增基因片段，但是扩增了一个基因片段，电泳检测发现竟然一片黑暗，啥都米有，连引物二聚体都米有。
明天打算再试试，试试体系和条件，哪位虫子有此类经验的，拜求交流^_^
回复此楼

» 猜你喜欢
我就是玉树临风胜潘安，一朵梨花压海棠的×××
1楼 2008-07-21 22:00:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):谢谢，继续帮忙啊
这么长的片段，汗……
一定要用适合long PCR的酶
如Takara的LA Taq
另外，预变性的时间要够长，才能充分打开模板的二级结构，必要时需要添加DMSO（需要摸浓度，太低太高都出不来。可以从体积比5%开始摸）
按照经验，1kb是1min的聚合时间，但你的片段这么长，就不知道能不能简单地按照这样线性地来算了
建议看看其他人是怎么做long PCR的
赞一下(10人) 回复此楼
2楼2008-07-21 22:59:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):呵呵，谢谢。继续探讨啊
我现在多用promega的gotaq，扩4-6kb没问题。差不多也是按照1kb/min，延伸温度68度。
扩增长片断可以考虑roche的expand and long taq我用的也可以
赞一下(10人) 回复此楼
3楼2008-07-22 05:39:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2008-7-21 22:59:
这么长的片段，汗……
一定要用适合long PCR的酶
如Takara的LA Taq
另外，预变性的时间要够长，才能充分打开模板的二级结构，必要时需要添加DMSO（需要摸浓度，太低太高都出不来。可以从体积比5%开始摸）
按照 ...

我用的酶是Chimerx的Taq DNA Polymerase，据说是比较好的酶哦，我也是第一次用这个酶~
赞一下 回复此楼
我就是玉树临风胜潘安，一朵梨花压海棠的×××
4楼2008-07-22 09:42:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白
引用回帖:
Originally posted by 克隆大虾 at 2008-7-22 05:39:
我现在多用promega的gotaq，扩4-6kb没问题。差不多也是按照1kb/min，延伸温度68度。
扩增长片断可以考虑roche的expand and long taq我用的也可以

扩增长片段时，我用延伸温度也是68°，7min
退火温度55°，只用了5s，请问你的退火温度和时间是怎么样的呀？
赞一下 回复此楼
我就是玉树临风胜潘安，一朵梨花压海棠的×××
5楼2008-07-22 09:44:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by shellyliu at 2008-7-22 02:44:

扩增长片段时，我用延伸温度也是68°，7min
退火温度55°，只用了5s，请问你的退火温度和时间是怎么样的呀？

退火温度根据你的引物,你可以做几个梯度.退火时间一般是30s或者45s.你的5s太短了
赞一下 回复此楼
6楼2008-07-22 17:27:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

figo.339

木虫 (著名写手)
首先预变性时间长些。延伸时间应该长些，你的是4Kb，延伸时间设定为5min试试。
赞一下 回复此楼
7楼2008-07-22 21:50:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 shellyliu 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 3/150 2026-11-05 21:05 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 3/150 2026-11-05 21:05 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-05 20:54 by qL1cU46YIdK0
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-05 20:45 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 7/350 2026-11-05 20:43 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 9/450 2026-11-05 20:34 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 8/400 2026-11-05 20:23 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-05 20:21 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-05 20:10 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 6/300 2026-11-05 18:00 by My20PsvIExYO
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 kvewwGtKktqB 2026-11-04 8/400 2026-11-05 17:47 by My20PsvIExYO
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 13/650 2026-11-05 17:47 by My20PsvIExYO
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-05 17:36 by My20PsvIExYO
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 9/450 2026-11-05 17:26 by My20PsvIExYO
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 9/450 2026-11-05 17:25 by My20PsvIExYO
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 19/950 2026-11-05 17:25 by My20PsvIExYO
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 16/800 2026-11-05 17:25 by My20PsvIExYO
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 13/650 2026-11-05 17:15 by My20PsvIExYO
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-05 15:46 by My20PsvIExYO
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 9/450 2026-11-05 15:13 by My20PsvIExYO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭