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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白

[交流] 关于巢氏PCR

今天扩增ND4ND5基因,大概4kb左右,电泳检测没有带,老师说通常情况也是这样滴。
我继续扩增基因片段,但是扩增了一个基因片段,电泳检测发现竟然一片黑暗,啥都米有,连引物二聚体都米有。
明天打算再试试,试试体系和条件,哪位虫子有此类经验的,拜求交流^_^
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我就是玉树临风胜潘安,一朵梨花压海棠的×××
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):谢谢,继续帮忙啊
这么长的片段,汗……
一定要用适合long PCR的酶
如Takara的LA Taq
另外,预变性的时间要够长,才能充分打开模板的二级结构,必要时需要添加DMSO(需要摸浓度,太低太高都出不来。可以从体积比5%开始摸)
按照经验,1kb是1min的聚合时间,但你的片段这么长,就不知道能不能简单地按照这样线性地来算了
建议看看其他人是怎么做long PCR的
2楼2008-07-21 22:59:39
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):呵呵,谢谢。继续探讨啊
我现在多用promega的gotaq,扩4-6kb没问题。差不多也是按照1kb/min,延伸温度68度。
扩增长片断可以考虑roche的expand and long taq我用的也可以
3楼2008-07-22 05:39:02
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shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2008-7-21 22:59:
这么长的片段,汗……
一定要用适合long PCR的酶
如Takara的LA Taq
另外,预变性的时间要够长,才能充分打开模板的二级结构,必要时需要添加DMSO(需要摸浓度,太低太高都出不来。可以从体积比5%开始摸)
按照 ...

我用的酶是Chimerx的Taq DNA Polymerase,据说是比较好的酶哦,我也是第一次用这个酶~
我就是玉树临风胜潘安,一朵梨花压海棠的×××
4楼2008-07-22 09:42:45
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shellyliu

金虫 (小有名气)

资深小白

引用回帖:
Originally posted by 克隆大虾 at 2008-7-22 05:39:
我现在多用promega的gotaq,扩4-6kb没问题。差不多也是按照1kb/min,延伸温度68度。
扩增长片断可以考虑roche的expand and long taq我用的也可以

扩增长片段时,我用延伸温度也是68°,7min
退火温度55°,只用了5s,请问你的退火温度和时间是怎么样的呀?
我就是玉树临风胜潘安,一朵梨花压海棠的×××
5楼2008-07-22 09:44:39
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by shellyliu at 2008-7-22 02:44:

扩增长片段时,我用延伸温度也是68°,7min
退火温度55°,只用了5s,请问你的退火温度和时间是怎么样的呀?

退火温度根据你的引物,你可以做几个梯度.退火时间一般是30s或者45s.你的5s太短了
6楼2008-07-22 17:27:01
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figo.339

木虫 (著名写手)

首先预变性时间长些。延伸时间应该长些,你的是4Kb,延伸时间设定为5min试试。
7楼2008-07-22 21:50:30
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