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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教：引物设计问题
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gzhnsf

[交流] 请教：引物设计问题

请教：
我现在在做一个基因的克隆，用的是简并引物，做PCR时得到了预计的大小的条带，但是最后测序后得到的是单引物扩增。请大家帮一下忙，解决这个问题的方法是什么？是重新设计引物还是继续摸索PCR的条件？
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1楼 2008-07-21 17:08:36
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liuli124125

铜虫 (初入文坛)
偶也遇到和你一样的问题，找不到引物序列，整准备重新做过拿去测序呢，我们可以交流一下吗
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2楼2008-07-22 22:53:09
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gzhnsf

好啊。
你有什么好的方法啊？
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3楼2008-07-23 09:11:43
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gyybyf

铜虫 (初入文坛)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
应该重新设计引物
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4楼2008-07-23 11:30:40
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zhang8211jie

铜虫 (小有名气)
这是由测序的原理决定的，测序结果是不会包括引物序列的
还有你测的是正向？反向？测通没有，通常正向测序结果在700-800bp之后的结果就不可靠了。你要想得到完整结果需要做反向测序在拼接正向测序结果。如果你的基因很长的话做walking测序，应可得到你的结果
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5楼2008-07-27 16:53:39
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beckham277

木虫 (职业作家)
我也做过   肯定你引物有问题了  重新设计  变化下条件
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6楼2008-07-28 00:57:56
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lanyu270

TA克隆 后送测序，TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。系统中也包含感受态细胞和S.O.C培养基, 使得实验操作更为简单方便。
所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理（Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆）。不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。

利用载体上的特异引物测序！！
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7楼2008-07-28 01:57:44
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