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pet22b 表达的目的蛋白分泌到细胞周质，如何有利于产物纯？求高手解答已有2人参与
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2楼2015-05-27 18:38:06
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
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3楼2015-05-28 08:27:05
恶魔的左眼
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- 专业: 蛋白质组学
【答案】应助回帖
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作为E.coli的异源蛋白,重组蛋白在E.coli中合成后有4种定位,即胞质(Cytoplasm)、周质空间(Periplasm)、内膜或外膜和细胞外基质中。在E.coli胞内表达虽然具有产量高、操作简便的优点,但由于胞内缺少真核生物中翻译后修饰所需的酶类,或缺乏蛋白折叠过程中需要的某些酶和辅助因子,致使中间体大量积聚,容易形成包含体沉淀。不可溶、无生物活性的包含体必须经过变性、复性等繁琐过程才能获得天然结构和生物活性,增加了工作难度和生产成本。鉴于这些缺点,人们把目光投向蛋白的分泌表达,即蛋白质跨过细菌的内膜定位于周质空间或穿过细菌外膜直接到达胞外培养基。 与胞内表达相比,重组蛋白分泌到胞周质或胞外培养基显示出了许多优势,具体表现如下: ①利用大肠杆菌蛋白表达系统,在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽,可将目的蛋白运送到周质空间。经信号肽酶将信号肽切除后,即可获得与天然蛋白一致的构象(不含N端多余的甲硫氨酸)。而如果含甲硫氨酸就可能降低产物的可溶性和稳定性; ②E.coli的胞周质中含有一系列的酶,并提供了一个氧化的环境,这些都有利于二硫键的正确形成,并增强硫基蛋白的正确折叠使活性蛋白质的产量得到提高; ③研究发现胞周质或胞外分泌表达能增强某些基因产物的可溶性; ④周质空间和胞外培养基中的蛋白酶活性要比胞质中低,使所表达的蛋白能避免 胞内降解从而稳定地存在于胞周质中; ⑤利用分泌这一策略,可极大简化下游工序,将来自宿主菌的污染减小到最低; ⑥蛋白分泌性表达,减少了对宿主菌的毒性和代谢负担,使宿主适应性增加。 其实说了这么多，就是分泌蛋白比胞内表达要稳定，目的蛋白不易降解，杂蛋白少易纯化。 |
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2015-05-28 09:36:48, 1.88 M
4楼2015-05-28 09:38:50