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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白上清表达无活性，求复性方法
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linden00

铜虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白上清表达无活性，求复性方法 已有2人参与

我的蛋白在上清中有大量表达，但是做EMSA检测无活性，看文献中是降低盐酸胍浓度来复性的。有没有人做过柱上复性的？想知道具体方法。我是应该直接按包涵体的方法复性还是上清在镍柱纯化的同时复性呢？另外蛋白中有几个半胱氨酸，没有二硫键，是不是一定要加巯基乙醇来保护巯基？
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1楼 2015-05-26 11:01:46
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MarchZR

银虫 (小有名气)
很多人好像都不了解一个概念，就是，原核表达的蛋白，如果是上清中表达的话，活性应该是有的，不是包涵体，不需要复性，因为上清本身就是可溶的，哪来的包涵体。第二个，原核表达蛋白如果是在包涵体中有表达，那就要复性，但是就算是复性成功了，对于蛋白活性也是没有保证的，意思就是如果采用原核系统表达（如大肠杆菌)大家都想要上清中的蛋白，不想要包涵体的蛋白，就算是复性了活性也不及真核表达的蛋白，所以对于活性有要求的应该用真核表达蛋白
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11楼2015-12-16 17:41:44
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
纳尼，在上清中不就是可溶的么？  你复性也是为了可溶呀？这不是画蛇添足么。
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3楼2015-05-26 15:42:07
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linden00

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by viki_MDK at 2015-05-26 15:42:07
纳尼，在上清中不就是可溶的么？  你复性也是为了可溶呀？这不是画蛇添足么。

但是上清无活性呀
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4楼2015-05-26 17:11:09
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
linden00: 金币+10 2015-05-27 10:04:33
如果是核酸结合蛋白，有没有考虑到buffer不适当，并不是蛋白没有活性？

比如加入10 mM Mg ++ ,  10 uM Zn ++?
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行至水穷处，坐看云起时
5楼2015-05-26 19:28:31
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