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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 见鬼了,测序结果下游引物丢失?
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)

[交流] 见鬼了,测序结果下游引物丢失?

条带大小1Kb左右.以菌液形式送去上海生工测序,要求测通.
今天测序结果电子版发过来.拼接后1300bp左右.上游引物序列完全匹配,但是下游引物序列(不论是酶切位点还是目的基因上的片段)都完全找不到.把下游反向互补,反向,互补,正向都比过了,一点影子都没有!难道见鬼了?

注:连接载体是pMD-19T Simple Vector.没有做蓝白斑,但是做过菌落PCR.之后划线分离后又作了一遍菌落PCR.验证阳性后送去的两管.其中一管没有测出来.
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1楼 2008-07-18 15:41:17
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donna181

金虫 (小有名气)

可能没有连上!

很正常,菌液PCR不准的,你提一下质粒做一下酶切吧!
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2楼2008-07-18 16:04:12
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bingzheyu

银虫 (小有名气)
当时在测序之前确实有必要先进行酶切验证的,再者会不会是测序公司未给全部序列给你.
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3楼2008-07-18 16:08:42
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by donna181 at 2008-7-18 16:04:
很正常,菌液PCR不准的,你提一下质粒做一下酶切吧!

谢谢！
我做的是菌落PCR。我也知道会有假阳性。但问题是测序结果中在前面确实出现了我上游引物的约30的bp，完全吻合。而下游却莫名其妙丢失了。
如果没连上这个也太巧合了吧。
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4楼2008-07-18 19:17:14
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bingzheyu at 2008-7-18 16:08:
当时在测序之前确实有必要先进行酶切验证的,再者会不会是测序公司未给全部序列给你.

恩。谢谢你朋友。
上海生工先是寄了上下游分别测序的结果。
过了不久又把拼接后的序列发了我。
我两者都试过了。只有上游，没有下游。
如果是下游某个测错也就算了。关键是我把下游序列比对之后发现这个可能性几乎为0.

而且两边测的话肯定会测到开始的引物序列的吧。
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5楼2008-07-18 19:20:09
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figo.339

木虫 (著名写手)
应该是测丢了。我以前也碰到过这个情况
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6楼2008-07-18 22:06:43
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)
朋友.谢谢你的回复.
你以前遇到的情况和我一样吗?
怎么测丢了呢?如果从下游开始测不是一开始就该测到吗?是就引物序列丢失,还是整个测错了?我能否要求他重新再测一遍呢.谢谢.
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7楼2008-07-19 08:18:11
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lxlian507

银虫 (小有名气)
不是测丢了，我觉得产物很可能是单引物扩增出来的，我也有这样的经历。单引物有时就能正确扩增出目的带的。
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学习就是进步，知足就是幸福！
8楼2008-07-19 09:17:25
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)
楼上的朋友谢谢你的回答，可单引物怎么扩增出目的条带？
最多是线性增加呀，30轮怎么也不可能电泳可见吧。
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9楼2008-07-19 14:30:24
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tcxuefeng

金虫 (正式写手)
问题得到解决.
原来上游引物及其反向互补序列组成了一对引物!大小约1KB左右.
可怕的巧合!

谢谢大家的帮助.
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10楼2008-07-20 13:25:46
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