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silentguy

铜虫 (小有名气)

[交流] 请教关于双向电泳

前几天第一次做双向电泳染色后发现啥也没有,换了一种染色方法还是没有,故排除染色问题。  又怀疑是等电聚焦出错,于是只用marker跑第二向,结果胶上还是很干净没有任何蛋白点。  这样我就觉得是第二向电泳有问题。每次只跑一块胶,原先的设置是10mA  80V  1W  1小时;390mA  600V  78W 6小时。(因为上层缓冲液槽漏液,故将电压电流设得都很大)。  后来发现没有结果,就将设置改为教程上所说的 10mA 80V  1W  1小时;12mA  150V  3W 6小时。 还是什么都没有。真奇怪。感觉步骤很简单啊,怎么会这样呢?  
我用的是Amersham 的电泳系统。哪位高人给点意见吧?谢谢!
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界

10mA  80V  1W  1小时;390mA  600V  78W 6小时???
我的印象中是等电聚焦的时间长呀?等电聚焦一般都是过夜的,还得控制电泳的温度?而第二方向的电泳基本上和普通的PAGE胶电泳没什么大的区别。你没有搞反了两次电泳的设置吧?
不必分享金币,也许不会解决你的问题。
位卑未敢忘忧国。
5楼2008-07-14 01:16:42
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merlynhuang

金虫 (小有名气)


silentguy(金币+1,VIP+0):非常感谢,恳请给点建议,呵呵
第二向,390mA  600V  78W 6小时???!!
12mA  150V  3W 6小时???!!
你是多大的胶?如果是小胶,估计早就跑出胶外了
重新泡论坛,才找回做实验的感觉
2楼2008-07-13 17:29:57
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silentguy

铜虫 (小有名气)

24cm的胶,呵呵,因为上层缓冲液槽漏液,所以咨询了一下GE的技术人员,人家说要把电压什么的调到最大,我也不记得电流和功率要不要调,就都调了。

弱问一般如何设置呢?12mA  150V  3W 应该是不大吧,这是over night 的设置了。

[ Last edited by silentguy on 2008-7-13 at 19:22 ]
3楼2008-07-13 19:20:00
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merlynhuang

金虫 (小有名气)

24cm的胶我没跑过,我认为首先考虑是上样量因素,如果太低的话,可能有些染色方法检测不到,当然如果排除染色液,电泳缓冲液问题,你要注意的是胶条与PAGE胶之间是否有气泡。还有我不赞成大电压跑,发热问题很严重。即便是有斑点,都可能出现横条纹和纵条纹。 好好的装板子,应该不会漏液,再一个注意下电极是否正确。

金币就不用了,可能这些因素没一条对,如果可以,下次把照片发上来。
重新泡论坛,才找回做实验的感觉
4楼2008-07-13 22:23:52
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