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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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habuking

[交流] 关于测序的问题

我用了M13引物做菌落PCR鉴定阳性克隆,电泳以后发现两条带,一条在1000bp左右,那应该是我的目的条带,但在200bp左右还有另外一条较弱的带,我初步估计应该是载体自连后,M13扩增出来的多克隆位点的序列,查找了载体图,在M13之间的多克隆位点差不多真的有200bp左右,由此可推断,我的单克隆菌里有两种载体,一种是PESSY-T3-目的蛋白,另一种是自连的空载,请问这样对我的测序结果有影响么?

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-16 at 20:56 ]
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jasco

木虫 (正式写手)

根据质粒不相容性原理,同种来源的质粒不可能同时存在于同一个大肠杆菌细胞中,所以如果你是跳取得单菌落的话,不可能载体自连和重组质粒都有的
6楼2008-07-10 11:40:46
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yxwjimmy

木虫 (正式写手)

你得到的阳性克隆都是这样吗?
如果真的如你推断的,肯定会影响测序结果的
2楼2008-07-08 20:50:48
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habuking

因为做的蓝白斑点筛选,就挑了两个白斑,开始用PCR引物做菌落PCR鉴定的,结果显示有一个是目的条带大小,就将那个平板扔了,以往都是用PCR引物做鉴定的。后来又借用别人的M13引物鉴定了一次,才发现出问题了,并且测序结果出来,说我有重叠峰。
载体自连的问题,应该是避免不了的,要不然,蓝白斑筛选就失去意义了,可是怎样才能避免自连载体跟连有目的蛋白的载体,同时进入感受态细胞呢?
3楼2008-07-09 13:21:36
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meizihan

新虫 (初入文坛)

转化进入感受态,涂平板挑单克隆,PCR检验就行了.
4楼2008-07-09 21:29:14
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