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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于测序的问题
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habuking

[交流] 关于测序的问题

我用了M13引物做菌落PCR鉴定阳性克隆，电泳以后发现两条带，一条在1000bp左右，那应该是我的目的条带，但在200bp左右还有另外一条较弱的带，我初步估计应该是载体自连后，M13扩增出来的多克隆位点的序列，查找了载体图，在M13之间的多克隆位点差不多真的有200bp左右,由此可推断，我的单克隆菌里有两种载体，一种是PESSY-T3-目的蛋白，另一种是自连的空载，请问这样对我的测序结果有影响么？

[ Last edited by 350784478 on 2009-7-16 at 20:56 ]
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1楼 2008-07-08 14:43:34
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yxwjimmy

木虫 (正式写手)
你得到的阳性克隆都是这样吗？
如果真的如你推断的，肯定会影响测序结果的
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2楼2008-07-08 20:50:48
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habuking

因为做的蓝白斑点筛选，就挑了两个白斑，开始用PCR引物做菌落PCR鉴定的，结果显示有一个是目的条带大小，就将那个平板扔了，以往都是用PCR引物做鉴定的。后来又借用别人的M13引物鉴定了一次，才发现出问题了，并且测序结果出来，说我有重叠峰。
载体自连的问题，应该是避免不了的，要不然，蓝白斑筛选就失去意义了，可是怎样才能避免自连载体跟连有目的蛋白的载体，同时进入感受态细胞呢？
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3楼2008-07-09 13:21:36
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meizihan

新虫 (初入文坛)
转化进入感受态,涂平板挑单克隆,PCR检验就行了.
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4楼2008-07-09 21:29:14
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yxwjimmy

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by habuking at 2008-7-9 13:21:
因为做的蓝白斑点筛选，就挑了两个白斑，开始用PCR引物做菌落PCR鉴定的，结果显示有一个是目的条带大小，就将那个平板扔了，以往都是用PCR引物做鉴定的。后来又借用别人的M13引物鉴定了一次，才发现出问题了，并且 ...

我觉得两种质粒同时进入受体菌的机率应该是很小的
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5楼2008-07-10 10:43:09
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jasco

木虫 (正式写手)
根据质粒不相容性原理，同种来源的质粒不可能同时存在于同一个大肠杆菌细胞中，所以如果你是跳取得单菌落的话，不可能载体自连和重组质粒都有的
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6楼2008-07-10 11:40:46
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