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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 毕赤酵母电转后在平板上单克隆应该太小太密，难以筛选怎么办？
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 毕赤酵母电转后在平板上单克隆应该太小太密，难以筛选怎么办？ 已有1人参与

我这几次做的pPIC9k电转GS115，电转后涂的RDB板，长出来的菌落非常的小而且密，搞的就很难把它影印到MM和MD板上进行筛选，很难标记。
我看我同门的是稀稀落落几颗一个平板上，感觉她的又太少了，因为手册上一般是筛选100个左右，她一个平板就6、7个的样子。
我之后还打算在MD和MM上筛选Mut+和Muts，再上G418平板，因为之前存在只有RDB板上的菌可以表达，转到其他板上后就无法表达的情况，所以最好在筛选后还能对应上最初的RDB平板上的菌落。
  我用Sac I线性化的9k，因为理论上插入HIS区（即用Sal I）的话只产生Mut+，而有文献说对于大分子量蛋白Muts更适合表达。表达手册上说Sac I也应该只产生Mut+，可是看了很多文献还是进行了Mut+和Muts的筛选。
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1楼 2015-04-13 11:32:21
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Dearstar

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主你要是浓度太高，可以刮下来，用无菌水稀释再重新涂布，这样会好很多。
我现在在也做一个类似的实验，对于理论上是mut+型，为什么还要做这一个筛选，我也一直有这个疑问。。难道是突变了，因为它们基因上有97%的同源性。。？
共勉之
引用操作手册上的原话：
毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1  及  AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是
AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性
蛋白的 30%以上。AOX1 基因已被分离，含 AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白
的目的基因的表达。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因
的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。AOX1 突变表型：
缺失  AOX1  基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为  Muts  的突变株
（methanol  utilization  slow），过去称为 Mut，而 Muts 可更精确地描述突变子的表型。结果
细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut +
（methanol utilization plus）
指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的
整合方式。
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2楼2015-06-04 09:27:07
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Dearstar at 2015-06-04 09:27:07
楼主你要是浓度太高，可以刮下来，用无菌水稀释再重新涂布，这样会好很多。
我现在在也做一个类似的实验，对于理论上是mut+型，为什么还要做这一个筛选，我也一直有这个疑问。。难道是突变了，因为它们基因上有97% ...

你的方法真是简单粗暴，我喜欢，确实之前没想到……我后来转化涂了不同菌液量的板，菌落少的那个板一样是长不大，我看网上有人说这是转化效率低，所以才小，所以在考虑用很久以前一篇文献提的那个高效酵母感受态制备方法。我最近做表达一直做不出来，各种纠结。至于mut和muts，我觉得做MM和MD似乎是没有意义的，因为我筛选的时候很明显有的在MM上偏小，但用通用引物验证都是mut，所以我认为应该以pcr验证为准。希望咱俩能多交流交流～

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3楼2015-06-04 13:28:35
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MeiPD

新虫 (小有名气)
你好，我的跟你一样，涂抗性平板，长出来的白色一层，很小很密集，根本没办法挑单菌落。后来我又重新转化涂MD平板筛选，结果一样，且未转化酵母涂MD的阴性对照也是这样，楼主你问题解决了吗？

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4楼2017-06-24 20:23:57
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gaiyin1002

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by MeiPD at 2017-06-24 20:23:57
你好，我的跟你一样，涂抗性平板，长出来的白色一层，很小很密集，根本没办法挑单菌落。后来我又重新转化涂MD平板筛选，结果一样，且未转化酵母涂MD的阴性对照也是这样，楼主你问题解决了吗？
...

楼主，我也是同样的问题，请问解决了吗？
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5楼2018-11-26 10:40:40
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