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fengkai6200

银虫 (小有名气)

[交流] 酵母表达

1.我最近在做毕赤酵母GS115表达小分子量蛋白。
得到了10个已经转入目的DNA的酵母单克隆,并对每个单克隆进行PCR检验。
我用a-factor引物和3‘-aox对所提的酵母DNA进行pcr,
结果得到目的带300bp左右,但是在500bp左右还有一条带,不知道是怎么回事了。
图一maker为100bp ladder,右边数第一个样品的质粒是ppic9k线性化后转入GS115中,目的片段是500bp是一条带。
其余样品都是我用的是ppiczaA线性化后转入GS115中的,引物全是a-factor引物和3‘-aox。



2.
后来我又用我目的片段的一段引物和3’-aox引物对 酵母DNA重新PCR 结果
有我的目的片段,但是还是有一段接近但小于500bp的序列。见图二从左到右
1引物为a-factor引物和3‘-aox
2引物为目的片段的一段引物和3’-aox引物 1和2模板是一个酵母
3引物为a-factor引物和3‘-aox
4引物为目的片段的一段引物和3’-aox引物  3和4模板是另一个酵母
其余样品与本实验无关


3.还有下边是我从左到右
1为100bp ladder marker
2是用a-factor和3‘-aox引物
3是用我的目的片段引物 和3’-aox引物对线性化的ppiczaA质粒的pcr结果。



我不懂了 为什么我会从酵母里pcr出两条带?
而且为什么ppic9k转入酵母的pcr结果是一条带,而ppiczaA转入酵母的pcr结果却是两条带呢?
请高手给予指点!!

[ Last edited by fengkai6200 on 2008-7-2 at 20:33 ]
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apple810

新虫 (初入文坛)

★ ★
fengkai6200(金币+2,VIP+0):感谢你的热心帮助
而且为什么ppic9k转入酵母的pcr结果是一条带,而ppiczaA转入酵母的pcr结果却是两条带呢?
可能是二者整合方式不同引起的。
PCR鉴定整合不靠谱,假阳性高,还可能不翻译。还是得从蛋白水平鉴定,你最终的目的是得到蛋白。
2楼2008-07-03 11:11:40
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fengkai6200

银虫 (小有名气)

谢谢你apple810
我就是想先通过pcr验证一下是否有目的片段插入
然后选择合适的诱导表达,理论上pcr应该得到1条带,现在得到了两条带。
写论文时候让我咋说啊?
3楼2008-07-05 09:11:33
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seahow

木虫 (著名写手)

★ ★
fengkai6200(金币+2,VIP+0):谢谢你,我感觉我p出来两条带,可能是因为插入位点的原因造成的。因为我是用sacI线性化的,在线性化载体两侧都有部分的5‘aox序列
你一定通过PCR检测,版主居然 还给了金币,呵呵, IFU,不能从蛋白水平检测,因为你是检测是否插入genome。

你仔细看看说明书,看看aox的位置,genome上有几个。
4楼2008-07-05 11:12:50
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apple810

新虫 (初入文坛)

插入genome,用southern 杂交,还能鉴定拷贝数.麻烦死人.
我不是说不用PCR鉴定,那只是个参考!不能绝对说明问题.
先鉴定蛋白后,心里面就有底了,发文章补充做个结果就行.
5楼2008-07-06 18:58:52
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