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[交流]
请问pet28表达质粒中连接目的片段使用那两个酶切位点
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| 各位大虾们，使用pcr产物直接进行酶切，然后连接到载体，但使用的酶切位点分别为：EcoR I和Not I,请问这两个位点能否一起使用啊，是否能高效率连到载体中啊，连到好多次，费了二个月了，还没连上，都快急死了，望各位多建言，出主意啊，多谢了！ |
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5楼2008-07-02 20:54:36
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1，保证PCR引物加的酶切位点要有足够的保护碱基、 2，EcoR 1,Not 1能不能一起使用，可以查一下有关酶的产品说明书或向酶的供应商咨询。比如， 3,感受态也很关键，保证感受态的转化效率达到要求。不然购买高效率的感受态也可以。 连接体系也优化一下了。 4，用笨但稳妥的方法：连接到T载体上，然后在酶切连接。 4，严格操作，细节决定成败。 5，不要灰心，相信自己！ 俺构建一个表达载体做了2个多月，弄得信心全无，怀疑自己是不是干这个的料。今天才发现其实我做出来了，只是一直酶切没条带。 后来发现是质粒量太少，酶切鉴定不成功。 明天诱导表达。哈哈， 你也加油啊，相信自己。 [ Last edited by xiaoyur on 2008-6-30 at 20:14 ] |
2楼2008-06-30 20:12:57
3楼2008-07-01 17:01:15
4楼2008-07-02 20:45:13