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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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wwfifa

铜虫 (小有名气)

[交流] 请问pet28表达质粒中连接目的片段使用那两个酶切位点

各位大虾们,使用pcr产物直接进行酶切,然后连接到载体,但使用的酶切位点分别为:EcoR I和Not I,请问这两个位点能否一起使用啊,是否能高效率连到载体中啊,连到好多次,费了二个月了,还没连上,都快急死了,望各位多建言,出主意啊,多谢了!
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xiaoyur

金虫 (著名写手)

1,保证PCR引物加的酶切位点要有足够的保护碱基、
2,EcoR 1,Not 1能不能一起使用,可以查一下有关酶的产品说明书或向酶的供应商咨询。比如,
3,感受态也很关键,保证感受态的转化效率达到要求。不然购买高效率的感受态也可以。
连接体系也优化一下了。
4,用笨但稳妥的方法:连接到T载体上,然后在酶切连接。
4,严格操作,细节决定成败。
5,不要灰心,相信自己!

俺构建一个表达载体做了2个多月,弄得信心全无,怀疑自己是不是干这个的料。今天才发现其实我做出来了,只是一直酶切没条带。
后来发现是质粒量太少,酶切鉴定不成功。
明天诱导表达。哈哈,
你也加油啊,相信自己。

[ Last edited by xiaoyur on 2008-6-30 at 20:14 ]
爱的反义词不是恨 而是冷漠!
2楼2008-06-30 20:12:57
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wwfifa

铜虫 (小有名气)

谢谢楼上的,版主给他加金币吧
3楼2008-07-01 17:01:15
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zyk_527

银虫 (小有名气)

我用的是fermentas的酶,也是这两个酶切位点,不过NotI是加了7个保护碱基,酶切是37°过夜,连接同样是fermentas的酶。4°过夜。感受态是自己做的,现用现做,连接转化,一个周一遍成功。
4楼2008-07-02 20:45:13
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zyk_527

银虫 (小有名气)

忘了说了,酶切的时候用的是O buffer
5楼2008-07-02 20:54:36
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