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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xiaricha

银虫 (小有名气)

[交流] 实验没有结果,请高手指点!(rt-pcr)

各位战友:我做实验遇到了很棘手的问题,希望高手点拨一下。
我提的RNA已经检测过了,应该没有问题。反转录体系如下:RNA 3UL,OLIGOD(T) 1 UL, DTT 1UL,第一链合成BUFFER 2ul ,0.5ul的DNTP,0.5ulRI ,0.5ulSuper SCRIPTII 反转录酶 ,补水至10ul。在做反转录前取2ulRNA,65度水浴5分钟然后冰裕。接下来PCR。这个体系有问题吗?
上游:CCCACACAGTCGCTCCATAG 57.8度
下游:AATCCTCGGTCCTTGCGTAG 57.9度   PCR反应体系如下:
1:10Xbuffer:2.5UL
2:引物各20UM 0.5uL
3:mgcl2(25mM)1.5uL
4:dNTP(2.5mM)4ul
5:模板加1ulcDNA.
6:rTaq酶0.5ul,
7:最后补水至25uL.
反应条件为:
1: 94度3分钟,
2: 94度30秒
3:(52-62)度30秒
4:72度2分钟
5:重复2-4 33到35个循环
6:72度10分钟
可为什么一直不出条带啊?真的很着急啊!到底是哪个地方出了问题啊?
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Kiddy

金虫 (小有名气)


lixiaoyi1981(金币+1,VIP+0):这个建议不错
在做反转录前取2ulRNA,65度水浴5分钟然后冰裕。接下来PCR
这是什么意思?把RNA水浴吗?
先将RNA\DNTP\OLIGODT\0.1DTT混合后65度5分钟,冰浴2-3分钟,再继续加入剩下的溶液和酶!这样应该是没问题的
你可以先做个内参,再pcr自己要的目的片断
3楼2008-06-27 10:12:09
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yangfang072

新虫 (初入文坛)

运气

我觉得做分子永远很诡异
明明全部都正确但就得不到
你继续努力
加油
运气到了就好了
2楼2008-06-27 09:28:40
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