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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 实验没有结果，请高手指点！（rt-pcr）
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xiaricha

银虫 (小有名气)

[交流] 实验没有结果，请高手指点！（rt-pcr）

各位战友：我做实验遇到了很棘手的问题，希望高手点拨一下。
我提的RNA已经检测过了，应该没有问题。反转录体系如下：RNA 3UL,OLIGOD(T) 1 UL, DTT 1UL,第一链合成BUFFER 2ul ，0.5ul的DNTP，0.5ulRI ,0.5ulSuper SCRIPTII 反转录酶 ，补水至10ul。在做反转录前取2ulRNA，65度水浴5分钟然后冰裕。接下来PCR。这个体系有问题吗？
上游:CCCACACAGTCGCTCCATAG 57.8度
下游:AATCCTCGGTCCTTGCGTAG 57.9度   PCR反应体系如下：
1：10Xbuffer:2.5UL
2：引物各20UM 0.5uL
3：mgcl2(25mM)1.5uL
4：dNTP(2.5mM)4ul
5：模板加1ulcDNA.
6：rTaq酶0.5ul，
7：最后补水至25uL.
反应条件为:
1: 94度3分钟,
2: 94度30秒
3：（52-62）度30秒
4:72度2分钟
5:重复2-4 33到35个循环
6:72度10分钟
可为什么一直不出条带啊？真的很着急啊！到底是哪个地方出了问题啊？
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1楼 2008-06-26 17:11:48
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yangfang072

新虫 (初入文坛)

运气

我觉得做分子永远很诡异
明明全部都正确但就得不到
你继续努力
加油
运气到了就好了
赞一下 回复此楼
2楼2008-06-27 09:28:40
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Kiddy

金虫 (小有名气)
★
lixiaoyi1981(金币+1,VIP+0):这个建议不错
在做反转录前取2ulRNA，65度水浴5分钟然后冰裕。接下来PCR
这是什么意思？把RNA水浴吗？
先将RNA\DNTP\OLIGODT\0.1DTT混合后65度5分钟，冰浴2-3分钟，再继续加入剩下的溶液和酶！这样应该是没问题的
你可以先做个内参，再pcr自己要的目的片断
赞一下(10人) 回复此楼
3楼2008-06-27 10:12:09
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