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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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cmtoon

木虫 (正式写手)


[交流] 【交流求助】请高手赐教His tag的PCR引物设计

下面是我设计的目的基因上下游引物:其中上游加了kozak序列和酶切位点,下游加了组氨酸标签和酶切位点,不知什么原因,PCR反应出不来目的条带?还有就是帮忙分析一下kozak序列是否正确?请高手帮忙分析一下,不胜感激!
up primer:5’CGCGGATCCGCACCATGTCGGCGCAGGCGGC3’
down primer:5’CCGGAATTCGCGTTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTCATCTTCTCCTTCATCCT3’
[search]his tag[/search]
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zyk_527

银虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
根据 Kozak序列:——G/N-C/N-C/N-ANNATGG——,感觉你的CGCACCATGT应该改为GCCACCATGG

[ Last edited by zyk_527 on 2008-7-11 at 14:48 ]
2楼2008-06-27 21:00:30
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cmtoon

木虫 (正式写手)


多谢仁兄的意见。我也是很怀疑我设计的KOZAK序列啊。那我再合成条引物试试,呵呵。
3楼2008-06-27 22:51:23
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zyk_527

银虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
其实PCR结果和KOZAK序列没有大影响呀,你分析过你的两条引物的退火温度了吗?相差大吗?你做过多少范围的温度梯度?温度确定不好,你可以加大引物的浓度(可10倍到100mM),假如温度非要很低才能扩出来,但非特异性高的话,你可以用2步法扩,先低温3-5个循环(可更少循环),再升高温度来25-30个循环。还有什么问题,我们互相讨论。祝你成功
4楼2008-06-28 13:10:46
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zyk_527

银虫 (小有名气)

你组氨酸也可以这样ATGGTGATGGTGATGATG,没必要都是GTG,这样会使CG含量过高的啦
5楼2008-06-28 13:16:48
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cmtoon

木虫 (正式写手)


★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
嗯,我的上下游Tm值都是很高的,因为GC含量很高。现在我 已经把下游的GTG改为ATG了,降低Tm值看看会不会好点。摸索的温度范围从54-62,每两度设一个条件。但是都没有出来。至于你说两步法,我还得进一步摸索看看结果如何。多谢仁兄的好建议。
6楼2008-06-29 12:13:11
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cmtoon

木虫 (正式写手)


多谢zyk_527仁兄的指点,现在目的片段通过两步法已经扩增出来且特异性很好。已经在进行连接转化了。谢谢啦!
7楼2008-07-10 11:19:17
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zyk_527

银虫 (小有名气)

呵呵,方法有用最好了,现在俺在找pLY-4质粒的图谱,能帮帮忙不?
8楼2008-07-11 14:45:30
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