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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【交流求助】请高手赐教His tag的PCR引物设计
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cmtoon

木虫 (正式写手)

[交流] 【交流求助】请高手赐教His tag的PCR引物设计

下面是我设计的目的基因上下游引物：其中上游加了kozak序列和酶切位点，下游加了组氨酸标签和酶切位点，不知什么原因，PCR反应出不来目的条带？还有就是帮忙分析一下kozak序列是否正确？请高手帮忙分析一下，不胜感激！
up primer：5’CGCGGATCCGCACCATGTCGGCGCAGGCGGC3’
down primer：5’CCGGAATTCGCGTTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTCATCTTCTCCTTCATCCT3’
[search]his tag[/search]
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1楼 2008-06-26 09:03:24
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zyk_527

银虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
根据 Kozak序列：——G/N-C/N-C/N-ANNATGG——，感觉你的CGCACCATGT应该改为GCCACCATGG

[ Last edited by zyk_527 on 2008-7-11 at 14:48 ]
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2楼2008-06-27 21:00:30
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cmtoon

木虫 (正式写手)
多谢仁兄的意见。我也是很怀疑我设计的KOZAK序列啊。那我再合成条引物试试，呵呵。
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3楼2008-06-27 22:51:23
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zyk_527

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
其实PCR结果和KOZAK序列没有大影响呀，你分析过你的两条引物的退火温度了吗？相差大吗？你做过多少范围的温度梯度？温度确定不好，你可以加大引物的浓度（可10倍到100mM），假如温度非要很低才能扩出来，但非特异性高的话，你可以用2步法扩，先低温3-5个循环（可更少循环），再升高温度来25-30个循环。还有什么问题，我们互相讨论。祝你成功
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4楼2008-06-28 13:10:46
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zyk_527

银虫 (小有名气)
你组氨酸也可以这样ATGGTGATGGTGATGATG，没必要都是GTG，这样会使CG含量过高的啦
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5楼2008-06-28 13:16:48
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cmtoon

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
嗯，我的上下游Tm值都是很高的，因为GC含量很高。现在我 已经把下游的GTG改为ATG了，降低Tm值看看会不会好点。摸索的温度范围从54-62，每两度设一个条件。但是都没有出来。至于你说两步法，我还得进一步摸索看看结果如何。多谢仁兄的好建议。
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6楼2008-06-29 12:13:11
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cmtoon

木虫 (正式写手)
多谢zyk_527仁兄的指点，现在目的片段通过两步法已经扩增出来且特异性很好。已经在进行连接转化了。谢谢啦！
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7楼2008-07-10 11:19:17
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zyk_527

银虫 (小有名气)
呵呵，方法有用最好了，现在俺在找pLY-4质粒的图谱，能帮帮忙不？
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8楼2008-07-11 14:45:30
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