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新虫 (小有名气)

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[交流] 请教：肿瘤试验专家评价一下我的肿瘤试验方案

试验的思路源自于：
有比较多的文献验证了如下的理论：
1、提高ROS水平，可以促使癌细胞凋亡，从而抗癌（比如：Targeting Oxidative Stress in Embryonal Rhabdomyosarcoma，Antioxidants Accelerate Lung Cancer Progression in Mice，Selective killing of cancer cells with a small molecule targeting
stress response to ROS等）；
2、提高ROS，可以调节免疫反应（具体是抑制），从而可以治疗自身免疫性疾病（比如：A New Arthritis Therapy with Oxidative Burst Inducers，Eriocalyxin B ameliorates experimental autoimmune ncephalomyelitis by suppressing Th1 and Th17 cells等），因为炎症和癌症有直接关系，如果将炎症消除，是不是部分对抗癌也是有益的？在这方面，有文献指出二甲双胍、布洛芬、阿司匹林等药物既有抗炎作用也有抗癌作用。
3、ROS水平提升有助于组织再生（比如Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration，
Sustained production of ROS triggers compensatory proliferation and is required for regeneration to proceed等
）。
结合以上三个思路，我们其实很容易的出，提高ROS有助于抗癌，而且可以做到标本兼治，首先，ROS有助于促进癌细胞凋亡，这是目前绝大多数治疗的目标；其次，ROS可以消除炎症，调节免疫反应，使癌细胞发生凋亡后，炎症不能促进新的癌细胞再生和转移；第三，当癌细胞和炎症细胞消失后，组织留下的伤口需要愈合，再利用ROS的促进再生作用达到伤口的快速愈合。因此只需补充或提供ROS就能够达到全方位抗癌的作用。
但是，在体内内源性的提高ROS显然不是一个简单的方法，比如节食、运动、雷帕霉素、二甲双胍等内源性提供ROS的产出，对于抗癌有一定作用，但是在临床利用上是远远不足的。既然内源性提高ROS是一个不可能完成的任务，那么外源性的补充ROS呢？这样是不是一个很棒的思路？
ROS一般是过氧化氢，一氧化氮，超氧阴离子，除了一氧化氮前体，很少有文献提到外源性补充这些物质，包括他们的前体，我想这些物质的特性造成了外源性补充不可行。
如果外源性补充ROS不可行，换一个思路，外源性补充类ROS是否可行？
正好，我手里有几个专利，其中用的的物质就具有很好的ROS特性，比如氧化还原电位、溶于水的情况等等。我做了很多实验，也验证了这种物质可以消炎也可以促进再生，在体外实验可以促进癌细胞的凋亡。我理所当然的任务这个物质可以抗癌，所以目前在进一步做动物实验。
几乎所有的抗衰老、抗癌、抗炎症的药物都可以找到ROS的因子，然大部分人还是受到自由基有害的影响而不顾证据就认为ROS是有害的。
具体的试验方案：
外源性补充类活性氧即二氧化氯溶液对肿瘤的影响研究
1 体外细胞实验
1.1 二氧化氯对肿瘤细胞的作用
1.1.1 用MTT法检测二氧化氯对肿瘤细胞（见下图）和正常细胞（见下图）活性的抑制作用。（二氧化氯浓度100ppm，1000ppm，2900ppm，高浓度（2%），pH值分1、4、6；高浓度添加DMSO(1:1)）
1.1.2 用AV/PI双染法计算二氧化氯针对肿瘤细胞的凋亡和坏死作用，研究二氧化氯对肿瘤细胞的具体杀灭作用。
1.1.3 利用Comet Assay分析二氧化氯对肿瘤细胞DNA damage。
1.2 二氧化氯对肿瘤细胞的作用机理
1.2.1 用HPF、mitosox red 结合流式细胞仪监测二氧化氯处理后的肿瘤细胞ROS水平。
1.2.2 用H2DCF-DA探针观察二氧化氯处理后的肿瘤细胞ROS水平，连续观察绘制变化曲线。
1.2.3 用二氧化氯处理后，5分钟内再分别用维生素E和过氧化氢酶处理后，再分别观察肿瘤细胞ROS水平，检测使用抗氧化剂是否抑制二氧化氯依靠氧化作用杀灭肿瘤细胞。
1.2.4 利用BODIPY 581/591 C11观察肿瘤细胞的氧化应激反应。
2 二氧化氯对肿瘤作用的体内试验
2.1 动物模型建立：C57BL/6小鼠200只，分对照组、药物高剂量组、药物中剂量组、药物低剂量组。
2.2 二氧化氯对动物体内肿瘤的作用：瘤内注射，7天一次，1-50天，对照组与二氧化氯浓度组（现配的高浓度添加DMSO(1:1)）。
2.2.1 每日测量肿瘤大小、动物体制、动物死亡情况，绘制肿瘤生长曲线和动物生存曲线。
2.2.2 选择1h、24h和72h肿瘤组织，进行HE染色，观察肿瘤病理情况。
2.3 免疫组化检测肿瘤组织。
2.3.1 Luminex技术（液相芯片检测技术）分别检测（注射后3天）肿瘤组织（和对照组）PD-1，IFN-γ，TGF-β，IL-2，VEGF，IGF-1，IL-1β和TNF-α蛋白含量。
2.3.2 分别检测对照组和试验组（注射后1天、3天和6天）肿瘤组织CD8+,CD4+,CD3+ TIL NKT 细胞数量。
2.3.3 在肿瘤接种后，每周一次用抗体mAbs消除CD4,CD8,NK细胞，观察缺乏免疫细胞的情况下，二氧化氯对肿瘤组织的影响。
（目的：观察用抗体消除CD8等T细胞前后，二氧化氯注射对于肿瘤的影响，来判断二氧化氯是否具有ROS的功能如激活T细胞免疫来促进肿瘤缩小）
2.3.4 在建立肿瘤模型的过程第3、6和9天腹腔给抗体mAbs消除CTLA-4/PD-1，注射后的若干天（比如21天），测量肿瘤细胞的大小。
（目的：观察缺乏与否肿瘤免疫T细胞负向调控通路CTLA-4/PD-1对二氧化氯对肿瘤细胞作用的影响，来判断二氧化氯是否具有ROS的功能如激活T细胞免疫来促进肿瘤缩小，此外可以和CTLA-4/PD-1做一个对照）
Sample Text
2.4 使用二氧化氯溶液注射正常组织，观察情况。
2.5 使用静脉注射，观察情况。

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