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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 急！连接失败，是什么原因？
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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 急！连接失败，是什么原因？

各位虫友：我的目的基因经TA克隆双酶切回收，载体为pET-22b（+），也经双酶切后回收酶切片断，我的酶切为点为NdeI和HindIII，经过多次实验，结果连接转化总是失败，筛不到阳性转化子，请问大家这最有可能是什么原因？
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1楼 2008-06-23 08:46:59
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lxxlxxhappy

铁虫 (初入文坛)
我的也是，同问
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2楼2008-06-23 17:32:33
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xiukuncui

木虫 (正式写手)
最常见的原因是其中一个酶或者两个酶没有切开，你可以做单酶切验证一下，
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3楼2008-06-23 19:08:00
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hoping1999

银虫 (正式写手)
延长载体酶切时间，连接加入少量载体，延长连接时间试试。同时看看是不是培养板子的问题。培养板不能超一月。
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4楼2008-06-23 21:25:00
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jasco

木虫 (正式写手)
这两种酶，Nde I比较难切，所以建议先用Nde I单酶切，确定切开后，再用Hind III酶切，还可以对载体在酶切后做去磷酸化，降低自连的背景

[ Last edited by jasco on 2008-6-24 at 16:01 ]
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5楼2008-06-24 11:31:58
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