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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 急!连接失败,是什么原因?

各位虫友:我的目的基因经TA克隆双酶切回收,载体为pET-22b(+),也经双酶切后回收酶切片断,我的酶切为点为NdeI和HindIII,经过多次实验,结果连接转化总是失败,筛不到阳性转化子,请问大家这最有可能是什么原因?
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jasco

木虫 (正式写手)

这两种酶,Nde I比较难切,所以建议先用Nde I单酶切,确定切开后,再用Hind III酶切,还可以对载体在酶切后做去磷酸化,降低自连的背景

[ Last edited by jasco on 2008-6-24 at 16:01 ]
5楼2008-06-24 11:31:58
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xiukuncui

木虫 (正式写手)

最常见的原因是其中一个酶或者两个酶没有切开,你可以做单酶切验证一下,
3楼2008-06-23 19:08:00
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hoping1999

银虫 (正式写手)

延长载体酶切时间,连接加入少量载体,延长连接时间试试。同时看看是不是培养板子的问题。培养板不能超一月。
4楼2008-06-23 21:25:00
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