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yylkmb

铁虫 (正式写手)

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[交流] 《读懂天然产物系列》-15-基因与化学联姻：破译生物合成70年未解之谜

文献：
Jack Davison, Ahmed al Fahad, Menghao Cai, Zhongshu Song, Samar Y. Yehia, Colin M. Lazarus, Andrew M. Bailey, Thomas J. Simpson, and Russell J. Cox. Genetic, molecular, and biochemical basis of fungal tropolone biosynthesis[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012, 109, 7642.

一.研究背景：
1. 真菌托酚酮（tropolone）类化合物的分离，结构鉴定及生物活性
1942年Harold Raistrick等人首次从一种青霉菌（Penicillium stipitatum）中分离得到stipitatic acid 1（密挤青霉酸），由于该化合物结构的特殊性和当时的有机化学的理论及实验条件的局限性，结构并未确定。直到1945年，Michael Dewar等人确定了该化合物的结构，并命名这类非苯的七元环芳香族化合物为托酚酮（tropolone）。这类化合物的发现和结构确定有力的推动了随后的有机化学理论的发展。在已经分离得到的这类化合物中puberulic acid 2具有很好的抗疟元虫活性（IC50 10 ng•mL −1），是一类潜在的抗疟药物。

F1.large.jpg
2.前期的生物合成研究：
1.1950年，Robert Robinson推测托酚酮生源上可能来源于多羟基酚类和甲醛(或者生源上等价的单元)的缩合。
2.1963年，Ronald Bentley利用14C标记的同位素饲喂实验确定化合物1的生物合成的前体是醋酸，丙二酸和一个一碳单元。随后的研究表明化合物3是化合物1生物合成中的前体。
3.稳定同位素标记实验表明，在扩环形成托酚酮骨架的过程中有一个来源于空气中氧气的氧原子引入到该分子中。这个实验结果与推测的苯环通过双氧化开环再环化形成托酚酮骨架的机理（route B, Scheme 1）相矛盾。（如果是双氧化，则分子中应该出现两个来源于氧气的氧原子）。因此可能的机理只有一种，化合物3通过氧化去芳构化形成中间体化合物4，再经过pinacol重排形成化合物1(route A, Scheme 1)。
4.论文作者实验室最近的一项研究表明，化合物3是一种真菌非还原型聚酮合酶的直接产物。

截至到作者发表文章时，该类化合物生物合成中扩环步骤的机理以及负责催化该步骤的酶仍然不清楚，真菌中通过氧化扩环形成托酚酮骨架的机理仍然是天然产物生物合成研究中一个时间最长的不解之谜。
二．研究内容:
1. Talaromyces stipitatus中负责托酚酮类化合物生物合成的基因簇的确定：
前期的生物合成研究已经确定化合物3是目标化合物生物合成的直接前体，而作者实验室在另外一项研究中发现来源于Acremonium strictum的一个基因aspks1能够编码合成一类NR-PKS(非还原型聚酮合酶)负责催化合成化合物3. 基于此利用生物信息学方法作者从产tropolone的Talaromyces stipitatus基因组中找到了4个包含与aspks1有较高同源性基因的基因簇，对它们经过进一步的分析发现其中有一个基因簇(含有NR-PKS（tspks1）基因)可能是负责目标化合物生物合成的Fig1，随后通过tspks1的基因敲除和异源表达实验证实了该基因簇确实跟目标化合物的生物合成有关。从Fig1中A和B中的色谱图可以看出，野生型的Talaromyces stipitatus能够产生tropolone类化合物1，6，5，8（A），而敲除了tspks1基因后的菌株不能产生该类化合物（B），说明tspks1基因跟目标化合物的生物合成有关。此外通过将tspks1基因在Aspergillus oryzae中表达，发现表达了tspks1基因的Aspergillus oryzae菌株能够产生原始菌株不能产生的化合物3（E），直接说明tspks1基因能够负责催化合成化合物3. 综合体内的基因敲除和体外的异源表达实验说明Fig1中展示的基因簇是负责目标化合物生物合成的基因簇。

F2.large.jpg
2.基因功能的确定
前期的生物合成研究表明，中间体化合物3转化成目标化合物的反应是一类氧化反应。因此催化该类反应的酶应该是一类氧化酶。对前面确定的基因簇中的基因进行分析发现有三个注释为氧化酶的基因（Fig1），分别是tsL1（FAD-dependent monooxygenase），tsL2（cytochrome P450 monooxygenase）tsR5(non-heme iron dioxygenase). 因此推测这三个基因可能是负责氧化扩环步骤的基因，为了验证它们的功能作者分别对三个基因进行基因敲除并对敲除后的菌株的发酵液的化学成分进行分析。结果发现：
a. 敲除了tsL1基因后的菌株不能产生tropolone类化合物，在其发酵液中积累了化合物3和化合物10，说明该基因跟氧化扩环步骤有关。
b. 敲除了tsR5基因后的菌株同样不能产生tropolone类化合物，在其发酵液中积累了化合物11，化合物12，化合物13，化合物14，说明该基因跟氧化扩环步骤有关。
c. 敲除了tsL2基因后的菌株能够产生化合物15和化合物16，说明该基因跟氧化扩环没关系。

F3.large.jpg
根据这些结果作者推测tsL1基因可能负责催化化合物3氧化生成化合物11，而tsR5基因可能负责催化化合物11氧化扩环生成化合物15. tsL2与扩环步骤没关系，而可能参与后修饰。为了进一步验证它们的功能作者又对这些基因进行了异源表达，结果发现异源表达获得的纯的tsL1编码的蛋白能够催化化合物3转化生成化合物11（Scheme3 B），而tsR5编码的蛋白能够催化化合物11转化生成化合物15（Scheme3 D）.结合基因敲除和异源表达实验，作者证明了从酚类化合物3转化到托酚酮类化合物15的过程中涉及两步酶催化的反应，其中tsL1基因编码的FAD-dependent monooxygenase负责催化化合物3氧化去芳构化形成化合物11，而tsR5基因编码的non-heme Fe(II)-dependent dioxygenase负责催化化合物11氧化扩环形成托酚酮类化合物15.

F4.large.jpg
三. 讨论:
1. tropA (tspks1)的基因敲除和异源表达实验证明该基因能够编码一个methylorcinaldehyde synthase (MOS)。在米曲霉中表达tropA (tspks1)基因使得该菌产生了两个原始菌株不能产生的化合物，化合物3和化合物9，其中化合物3是目标化合物生物合成的中间体，而化合物9在之前的研究中发现是T. stipitatus的代谢产物，此外也是A. strictum 菌中MOS的副产物。
2. tropB（tsL1）和tropC（tsR5）的基因敲除和异源表达实验证实了S c h e m e 1中推测的氧化扩环途径，但令人意外的是该转化实际上经过两步反应完成，首先由tsL1基因编码的FAD-dependent monooxygenase负责催化化合物3氧化去芳构化形成化合物11，而后tsR5基因编码的non-heme Fe(II)-dependent dioxygenase负责催化化合物11氧化扩环形成托酚酮类化合物15。
3.从前面的研究结果可以得出结论，真菌托酚酮类化合物的生物合成最少需要三个酶：一个负责合成前体化合物3的非还原型聚酮合酶，一个FAD依赖的单氧化酶，一个非二价铁离子依赖的双氧化酶。基于这个信息作者对其他已经公布基因组的真菌进行生物信息学分析，发现超过10种真菌含有推测的负责合成托酚酮类化合物的基因簇（Table 1），这为随后的通过基因挖掘获得这类化合物提供了一个很好的依据。
4..本实验中的研究结果还对其他真菌来源的天然产物的生物合成途径的解析有重要意义。（Scheme 5）

未命名.JPG

F6.large.jpg
四.评述：
这篇文章的选题非常好，目标化合物的结构新颖，活性好，有很好的前期研究基础并且具有潜在的应用价值。研究思路清晰，实验证据充分是近年来生物合成研究中的经典文献之一。
1.前体化合物3及其负责该化合物生物合成的NR-PKS基因的确定是该研究成功的关键。
微生物中负责次生代谢产物生物合成的基因成簇分布的现象是近年来该领域研究取得突破性进展的最主要的原因。通常在研究过程中根据目标化合物结构特征，首先推测负责目标化合物骨架合成的基因，然后根据该基因确定出基因簇，最后利用基因敲除和异源表达等实验确定基因簇中单个基因的功能。在常见的聚酮（PKS）和非核糖体多肽（NRPS）类化合物的生物合成研究中，由于有很好的前期基础目前已经可以根据化合物结构特征推测出负责该化合物生物合成的酶的类型，进而根据生物信息学分析推测出可能的基因。在本研究中目标化合物结构中托酚酮骨架比较新颖，其生物合成没有可用的酶学和基因方面的东西参考，因此推测基因很困难。而化合物3是一个典型的非还原型聚酮，此外前期的研究已经确定了负责该化合物生物合成的基因。结合化合物3是目标化合物生物合成过程中的前体，利用生物信息学方法作者很容易找到了负责目标化合物生物合成的基因簇。之后的研究只需要按照常规的方法进行。
2.遗传操作的熟练应用是该研究成功的有力保障:
除了前面提到的基因成簇分布，与植物相比微生物生物合成容易研究的另一个原因就是遗传操作相对成熟简单。目前基因敲除是生物合成研究中最常用也是最好的确定基因功能的方法。与原核生物相比本研究中用到的丝状真菌的基因敲除技术仍然相当复杂，但作者成功的对4个备选基因进行了敲除。此外，聚酮合酶属于功能复杂的较大蛋白很难在大肠杆菌和酵母里面进行表达，而利用米曲霉等丝状真菌对这类蛋白进行异源表达是最近才开发的方法，很幸运作者实验室是全世界为数不多掌握该技术的实验室之一，他们成功的将tropA (tspks1)基因在米曲霉中进行了表达并且确定了功能
3.基因敲除的菌株积累的中间产物的分离纯化，结构鉴定必不可少：
天然产物生物合成研究是一项涉及到多学科的研究，需要用到多种实验技术。这其中中间体化合物，目标化合物的分离纯化及结构鉴定是必不可少的。在本研究中敲除了tsL1基因后的菌株在发酵液中积累了中间体化合物3和化合物10，敲除了tsR5基因后的菌株在发酵液中积累了化合物11，化合物12，化合物13，化合物14。实验中作者成功分离得到了这些中间体化合物并确定了结构，这对于备选基因的功能鉴定和目标化合物生物合成的途径解析必不可少。
4.关于本文的通讯作者Russell J. Cox：
Russell J. Cox是真菌次生代谢产物生物合成研究领域中的大牛之一，虽然不像德国HKI的Christian Hertweck和Scripps的Bradley Moore等人那样高产，但是他的研究有自己的特色可以独树一帜，很多研究的选题非常有意思比如真菌来源的高度还原型聚酮合酶（HR-PKS）的程序化控制机制的研究，实验设计非常精妙。近年来贡献了多篇生物合成领域的经典文献，是本人最崇拜的生物合成领域的大牛。感兴趣的虫友可以去他课题组网站看看：http://www.cox-group.uni-hannover.de/377.html，http://www.bris.ac.uk/chemistry/people/russell-j-cox/。
五.讨论交流：
芳香族化合物结构中苯环骨架部分相对于取代基显得比较稳定，通常我们认为骨架不容易变化，因此我们认为产生这类化合物最主要的途径莽草酸途径和聚酮途径产生的化合物通常都是芳香族化合物如苯丙素，木脂素，黄酮等化合物，然而在早期的研究过程中人们就发现芳环有可能通过本身的扩环，缩环，开环等方式产生结构多样的次生代谢产物，只是这些理论很多都是推测，直到今天仍然缺乏实验证据，本文的研究为苯环氧化扩环形成七元碳环类化合物提供了很好的证据。我对苯环的代谢多样性非常感兴趣，自己总结过一些代表性的例子，在这贴出来一些希望感兴趣的虫友或者研究中碰到过这类化合物的可以交流下。
1..苯环氧化扩环形成七元碳环：
这类化合物比较常见，除了这篇文献中提到的化合物还有秋水仙碱。

1.JPG
2.苯环氧化扩环形成七元氧杂环：

mcontent.gif
3.苯环缩环形成五元碳环化合物

未命名2.JPG
4.苯环缩环形成五元内酯环
由于时间关系先写这么多，希望大家能够积极分享一下自己遇到或者看到过的有关芳环代谢多样性的例子。[ Last edited by yylkmb on 2015-2-2 at 01:02 ]

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1楼2015-02-02 00:35:02

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wangkaibo123

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非常感谢楼主的精彩撰写，的确是很经典的生物合成的好文章。能够否定一种生合成途径，然后提出一种更合理的生合成途径，并通过一系列的推理，假设，实验验证，成功说明这种生合成推测的合理性。非常nice。
最近我突然觉得，作为一名天然药化的人，生合成的确的好好补充学习下，正在看一些书籍补充知识。对于您说的苯环扩环可能关注的比较少，但是我对另一个方面非常感兴趣，最近关注不少文章，发现消旋体在自然界中普遍纯在，对于为什么产生消旋体？是生物体内酶活力不够？还是为了适应某种需要，酶本身就容易产生消旋体呢？对于这个问题很困惑，不知楼主是否有独到见解。如楼主叙述秋水仙碱中的第一个前提化合物，他是通过类曼尼烯反应合成的，此处他是立体专一性的，但是当苄基换成普通甲基或者脂肪链时，往往形成了消旋体，这类反应我觉得催化的酶应该是一样的，但是为什么会在不同的情况下形成立体专一性或者非专一性的化合物呢？是前提化合物的空间阻碍影响的还是什么原因?希望楼主能帮忙思考解释下？非常感谢