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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » wb问题请教
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yuzhoumeinv

银虫 (初入文坛)

[求助] wb问题请教 已有2人参与

我今天做的wb，应该是有S6K、磷酸化S6K、S6、磷酸化S6，结果显影什么也没有，请问会是什么原因？后来我用一块胶显影1分钟，勉强能看到S6K，但是同一行有的深有的浅，我操作上有什么失误吗？
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1楼 2015-01-31 23:16:11
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yuzhoumeinv: 金币+1, ★有帮助 2015-02-05 09:49:14
磷酸化的蛋白相对来说比较难做，wb不成功有很多原因，首先可能是抗体本身的效价不好，可以调整一二抗的比例，其次就是在wb过程中的操作问题，比如蛋白的含量，转膜调节，或者抗体孵育的问题，还需注意的一个问题是显影过程，一般显影时加上显影液后一定要先反应一会（一到两分钟左右），然后再进行压片，如果1分不够，就继续增加压片时间，但如果你压了半个小时仍然没有显出，那你就重新做吧。
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医学&统计学
2楼2015-02-01 11:23:12
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yuzhoumeinv

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 董博士 at 2015-02-01 11:23:12
磷酸化的蛋白相对来说比较难做，wb不成功有很多原因，首先可能是抗体本身的效价不好，可以调整一二抗的比例，其次就是在wb过程中的操作问题，比如蛋白的含量，转膜调节，或者抗体孵育的问题，还需注意的一个问题是显 ...

请问转膜过程需要注意的有什么呢
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3楼2015-02-01 21:22:20
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废哥117

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuzhoumeinv at 2015-02-01 21:22:20
请问转膜过程需要注意的有什么呢...

转膜过程中需要注意的有很多，恒流or恒压转膜效果都不同，转膜温度控制，PVDF膜的激活，膜与胶的贴合是否有气泡，转膜的时间与分子量大小，膜的孔径，转膜液的配制也至关重要，反正要注意的很多，转膜是个细活，你要慢慢积累经验
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不断提高自己
4楼2015-02-02 11:22:04
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yuzhoumeinv

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 废哥117 at 2015-02-02 11:22:04
转膜过程中需要注意的有很多，恒流or恒压转膜效果都不同，转膜温度控制，PVDF膜的激活，膜与胶的贴合是否有气泡，转膜的时间与分子量大小，膜的孔径，转膜液的配制也至关重要，反正要注意的很多，转膜是个细活，你 ...

5楼2015-02-03 09:28:52
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
磷酸化的抗体还是cst的比较好     细胞裂解液要加磷酸酶抑制剂
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6楼2015-02-03 19:28:30
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