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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木
LZ,你的阳性对照没有啊！这个优先考虑解决

[ 发自小木虫客户端 ]
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啊木
21楼2015-01-28 17:37:41
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wandinerrisa

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

转膜时间太短了吧，我们一般用湿转200mA，2h
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22楼2015-01-30 00:07:26
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qwbio123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

mark也看不清楚，条带能看出有来，感觉就像粘在一起了，是不是电泳时间不够啊，因为这个影响因素较多，你需要一个一个排除。
Western Blot常见问题分析这是个技术贴希望对你分析实验有帮助http://www.bioconsumable.com/cn/tech/2012/4-23/tech_62582186.htm
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23楼2015-01-30 14:09:27
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HaiGene

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

从加倍后的图看是可以杂出目的条带的，现在有两个问题1.泳道有拖带背景，2.杂交条带连在一起且带型不规则。

这种问题主要是蛋白提取的不好，可用超强RIPA提取，另外泳道有背景和条带连在一起是因为没有去除蛋白中的DNA，建议在提取蛋白时加入Benzonase核酸酶消化dna。另外，制胶时务必使各组分混合均匀后灌胶。
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24楼2015-03-04 14:12:02
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

转膜也是恒压？LZ你洗膜时间也太长了吧，1h有点长，会不会把蛋白都摇洗掉了。。。
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25楼2015-05-15 09:53:06
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zmxwfd

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

15V，30min半干转时间是不是有问题？你们实验室有人做过这个大小的转膜么？问下你们实验室的同事，确认没问题在做下一步
试试ECL显色孵育1min，会不会曝光过度？
我觉得 你转膜有问题，我们半干转一般都是7min
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26楼2015-05-15 20:31:03
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

为什么扫出来的图这么难看
条带拖尾蛋白没有裂解开，或者不溶的蛋白太多，如果是冰冻样品可以再沸水浴一下，然后简短离心取上清跑电泳，提蛋白时候超声几下也有好处。在确认下实验室的SDS试剂浓度和质量没问题。
可以试下湿法转膜。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
27楼2015-05-17 10:28:11
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siriusxuan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-05-15 09:53:06
转膜也是恒压？LZ你洗膜时间也太长了吧，1h有点长，会不会把蛋白都摇洗掉了。。。

洗上一整天也洗不掉。。。。
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此座可言轻社稷，江山万里起风尘。
28楼2015-05-17 10:29:01
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mazhenggen

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

做west blot 是个比较需要有经验的实验，特别是蛋白表达量很低的时候。导致失败的因素很多，需要逐个排除：1、确保蛋白转膜成功，可以用预染Marker 进行SDS-PAGE，观察一下就知道了；2、一抗的浓度非常关键，多了背景太深，少了不显色。所以用不同比列浓度的一抗进行摸索实验，至少得三个梯度吧，多点更好。找到一抗的适合浓度之后，下次重复实验就爱可以用最佳的一抗浓度了。3，确定二抗的来源是否与一抗对应，比如兔抗鼠、鼠抗人等；4，确保显色剂没有问题。5，一定需要一个阳性对照，如果阳性对照没有问题，说明实验操作本身没有问题。
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我喜欢所以我做
29楼2015-05-17 10:40:15
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