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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

LZ,你的阳性对照没有啊!这个优先考虑解决

[ 发自小木虫客户端 ]
啊木
21楼2015-01-28 17:37:41
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wandinerrisa

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

转膜时间太短了吧,我们一般用湿转200mA,2h
22楼2015-01-30 00:07:26
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qwbio123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

mark也看不清楚,条带能看出有来,感觉就像粘在一起了,是不是电泳时间不够啊,因为这个影响因素较多,你需要一个一个排除。
Western Blot常见问题分析这是个技术贴希望对你分析实验有帮助http://www.bioconsumable.com/cn/tech/2012/4-23/tech_62582186.htm
23楼2015-01-30 14:09:27
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HaiGene

新虫 (初入文坛)


【答案】应助回帖

从加倍后的图看是可以杂出目的条带的,现在有两个问题1.泳道有拖带背景,2.杂交条带连在一起且带型不规则。

这种问题主要是蛋白提取的不好,可用超强RIPA提取,另外泳道有背景和条带连在一起是因为没有去除蛋白中的DNA,建议在提取蛋白时加入Benzonase核酸酶消化dna。另外,制胶时务必使各组分混合均匀后灌胶。
24楼2015-03-04 14:12:02
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

转膜也是恒压?LZ你洗膜时间也太长了吧,1h有点长,会不会把蛋白都摇洗掉了。。。
25楼2015-05-15 09:53:06
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zmxwfd

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

15V,30min半干转时间是不是有问题?你们实验室有人做过这个大小的转膜么?问下你们实验室的同事,确认没问题在做下一步
试试ECL显色孵育1min,会不会曝光过度?
我觉得 你转膜有问题,我们半干转一般都是7min
26楼2015-05-15 20:31:03
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

为什么扫出来的图这么难看
条带拖尾蛋白没有裂解开,或者不溶的蛋白太多,如果是冰冻样品可以再沸水浴一下,然后简短离心取上清跑电泳,提蛋白时候超声几下也有好处。在确认下实验室的SDS试剂浓度和质量没问题。
可以试下湿法转膜。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
27楼2015-05-17 10:28:11
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siriusxuan

木虫 (正式写手)

引用回帖:
25楼: Originally posted by 曼舞流苏 at 2015-05-15 09:53:06
转膜也是恒压?LZ你洗膜时间也太长了吧,1h有点长,会不会把蛋白都摇洗掉了。。。

洗上一整天也洗不掉。。。。
此座可言轻社稷,江山万里起风尘。
28楼2015-05-17 10:29:01
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mazhenggen

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

做west blot 是个比较需要有经验的实验,特别是蛋白表达量很低的时候。导致失败的因素很多,需要逐个排除:1、确保蛋白转膜成功,可以用预染Marker 进行SDS-PAGE,观察一下就知道了;2、一抗的浓度非常关键,多了背景太深,少了不显色。所以用不同比列浓度的一抗进行摸索实验,至少得三个梯度吧,多点更好。找到一抗的适合浓度之后,下次重复实验就爱可以用最佳的一抗浓度了。3,确定二抗的来源是否与一抗对应,比如兔抗鼠、鼠抗人等;4,确保显色剂没有问题。5,一定需要一个阳性对照,如果阳性对照没有问题,说明实验操作本身没有问题。
我喜欢所以我做
29楼2015-05-17 10:40:15
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