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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！
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好纠结

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！ 已有20人参与

在做一个大小为32kDa的蛋白，是abcam的，按照计算的正常上样量，结果如图（已做完内参，没有问题）。怀疑是目的蛋白的表达量不够，增加上样量的结果如图。
实验的大致过程如下
1，电泳
60V(30min),80V（30min）,100V跑到底
2 转膜
半干转，15V（30min）,硝酸纤维素膜
3 封闭
37℃2h,3h,4℃过夜都试过,未发现太大影响（都做不出结果）。
4 一抗
4℃过夜或者37℃2h（根据封闭的时间选择），稀释度是按照说明书上的要求1：1000
5 洗膜
TBST 10min/次×6
6 二抗
37℃1h，稀释度1:5000
7 洗膜
同上
8 显影
ECL暗室处理3min（说明书要求，没问题），照相时的时间选择是5s,200s,50张。
抗体是用PBS稀释（实验室一直都是这么做的），试过用3%BSA稀释，无变化。
小弟已经实在想不出为什么了（快疯），请各位师兄师姐发发慈悲给小弟直条明路吧。

请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！
正常上样量


请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！-1
上样量加倍


请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！-2
最大上样量
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1楼 2015-01-26 09:23:47
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HaiGene

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

从加倍后的图看是可以杂出目的条带的，现在有两个问题1.泳道有拖带背景，2.杂交条带连在一起且带型不规则。

这种问题主要是蛋白提取的不好，可用超强RIPA提取，另外泳道有背景和条带连在一起是因为没有去除蛋白中的DNA，建议在提取蛋白时加入Benzonase核酸酶消化dna。另外，制胶时务必使各组分混合均匀后灌胶。
赞一下(1人) 回复此楼
24楼2015-03-04 14:12:02
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查看全部 29 个回答

qq705369449

银虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 屏蔽内容, 无应助，字符乱码 2015-01-26 20:10:02
本帖内容被屏蔽
2楼2015-01-26 10:43:20
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
好纠结(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-26 20:10:13
跑个SDS-PAGE看看，貌似有条带。
赞一下 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2015-01-26 12:08:14
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好纠结

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-26 12:08:14
跑个SDS-PAGE看看，貌似有条带。

什么意思？这就是跑完PAGE电泳往下做出来的结果呀？
赞一下 回复此楼
4楼2015-01-26 14:20:11
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